代谢控制发酵考卷.docx

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代谢控制发酵考卷

题号

一

二

三

四

五

六

七

八

总成绩

得分

得分

一、名词解释（共22分）

1.Metaboliccontrolfermentation（3分）

它是采用分子生物学、（基因重组技术）或其它生物化学的方法，人为地在DNA水平上，改变和控制微生物的特性，使有用的代谢产物生成和积累的发酵技术。

2.Pasteureffect（3分）

巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现，在通氧的情况下，由于进行呼吸作用，酒精产量大大下降，糖的消耗速度也变缓，这种有氧呼吸抑制发酵的作用被后人称为巴斯德效应。

其实质是能荷对代谢的调节。

3.Energycharge（3分）

能荷是一个表示细胞能量状态的参数。

是细胞中所含腺苷酸中含有相当于ATP的数量百分比，其表示式为：

能荷=（[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）×100%

4.Concertedinhibition（3分）

协同反馈抑制：

分支代谢的两个（或多个）终产物共同地而不是单独地过量存在时，对公共途径的第一个酶发生反馈抑制。

ABCDE

FG

5.Cooperate（synergistic）inhibition（3分）

15%

ABCDE

20%

FG

当任何一个终产物单独过剩时，都会部分地反馈抑制初始酶的活性，两个以上

的终产物同时过剩4，产生强烈的抑制作用，其抑制作用大于各自单独存在时的和。

6.Metabolicinterlock（3分）

代谢互锁：

BCD

AEF

GHI

XY

分支途径上游的某个酶G——H受到另一条分支途径的终产物，甚至与本分支途径几乎不相关的代谢中间代谢的抑制或激活。

使酶的活力受到调节。

7.Analogue--resistancemutant（4分）

抗代谢类似物的突变株：

通过诱导等手段获得突变株，已解除了终产物对酶的反馈调节，也就是说终产物A不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合。

那么A的结构类似物A1也同样不再与调节酶的调节部位或胞质阻遏蛋白结合，也就是A1对菌株的毒害作用表现不出来，我们就说该菌株对A1有抗性（resistance），此菌株即成为抗代谢类似物的突变株。

二、填空（10分）每空白点2.5分

在下列营养条件下填写E.coli的乳糖糖操纵子的表达方式：

1、当无葡萄糖、细胞cAMP水平低、又无乳糖糖糖时，不生长

2、当无葡萄糖、细胞cAMP水平高、有乳糖糖糖时，大量表达

3、当有葡萄糖、细胞cAMP水平低、又无乳糖糖时，不表达

4、当有葡萄糖、细胞cAMP水平高、有乳糖糖时，少量表达

三、画图并简述（28分）

1、试述普通酶和变构酶反应动力学性质的不同。

（8分）

变构酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂的浓度）的关系曲线呈S型，有协同性；当底物或效应物浓度极低时，酶反应速度的变化极微小，这是因为效应物浓度极低时，不具有协同性，当效应物浓度超过某个水平（阈值）时酶反应速度急剧增大（减小）。

即存在着底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。

这在代谢控制上具有很大的生理意义。

而普通酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂的浓度）的关系曲线为双曲线，没有协同性。

变构酶的反应动力学不同于普通酶的，它不符合米氏动力学方程式。

普通酶反应速度和底物浓度的关系为：

V=（Vmax[S]）/（Km+[S]）

变构酶反应速度和底物浓度的关系为：

V=（Vmax[S]）n/（Km+[S]n）

V：

酶促反应速度，Vmax：

最大反应速度，S：

底物浓度，Km：

米氏常数，n：

亚基数

2、阿拉伯糖对E.coli阿拉伯糖操纵子的诱导机制（10分）

4试比较酿酒酵母和运动发酵短杆菌酒精发酵的异同点。

（10分）

酿酒酵母和运动发酵短杆菌酒精发酵的异同点酿酒酵母和运动发酵短杆菌酒精发酵的异同点

比较项目

酿酒酵母

运动发酵短杆菌

相

同

点

①代谢方式

②原料

③代谢终产物

无氧发酵，产能代谢

葡萄糖

都有CH3CH2OH,CO2

无氧发酵，产能代谢

葡萄糖

都有CH3CH2OH,CO2

不

同

点

1代谢途径

2产能

3丙酮酸来源

4途径关键酶

5发酵温度

6初始pH

7产生丙酮酸步骤

8对乙醇的耐受力

9总反应式

EMP

净生成2ATP

3-磷酸甘油醛经过EMP途径转化

己糖激酶、磷酸果糖激酶

较低

较低，4.5~5.0

10步

耐受力较高（10%-18%）

C6H12O6+2ADP+2Pi+2H+→2CH3CH2OH+2H2O+2CO2+2ATP

ED

净生成1ATP

1分子由3-磷酸甘油醛经EMP途径转化，1分子由KDPG裂解得到

己糖激酶

较高

较高，在6.5左右

4步

耐受力较低（7%）

C6H12O6+ADP+Pi→2CH3CH2OH+2CO2+ATP

四、请论述和回答（40分）

1．请总结黑曲霉柠檬酸产生菌的柠檬酸发酵机制（15分）

葡萄糖发酵生成柠檬酸的理想途径是：

1mol的葡萄糖经糖酵解途径转变为二摩尔丙酮酸，其中1mol丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶（PDH）脱氢脱CO2生成乙酰辅酶A，另一摩尔丙酮酸在丙酮酸羧化酶（PC）的CO2固定反应生成草酰乙酸，进而生成苹果酸；乙酰辅酶A与苹果酸进入线粒体内，苹果酸再生成草酰乙酸，通过线粒体内的柠檬酸合成酶（CS）的缩合作用下，生成柠檬酸。

C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O

在碳平衡方面没有碳原子的损失，在乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子，对糖的转化率为106.7%

黑曲霉柠檬酸产生菌积累和生成柠檬酸的发酵机制主要有：

①由于严格限制供给锰离子（激活剂），从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大。

（Mn2+↓→HMP↓→合成蛋白（核酸）↓→NH4+↑→PFK↑→柠檬酸）；

②存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但不产生ATP，这样使细胞内ATP浓度下降，促使EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成；

③丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和草酸乙酸的供给，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力；

④α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环降低细胞内ATP浓度，另使α-酮戊二酸浓度升高，反过来反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解；

⑤顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：

顺乌头酸：

异柠檬酸=9：

3：

7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，而柠檬酸分解活力低，一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从而进一步促使柠檬酸的自身积累，PH降至2.0以下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累并排出体外。

2.试设计筛选高产L-赖氨酸的科研方案（包括出发菌株的选择、生物合成途径的调节机制、遗传标记的筛选、发酵条件的控制等）。

（25分）

答：

（一）采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌等Glu产生菌选为出发菌株进行诱变或DNA重组技术选育高产Lys菌株。

因为黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等Glu生产菌中的关键酶AK却都是单一的，该酶受Thr+Lys的协同反馈抑制。

此外还有以下与大肠杆菌不同：

（1）没有发现对Asp激酶（AK）或天冬氨酸半醛脱氢酶的反馈阻遏。

（2）Thr往下代谢生成Ile途径的第一个酶Thr脱氨酶受Ile的反馈抑制，减弱Thr的分解，这对Lys的积累十分有益。

（二）谷氨酸产生菌的赖氨酸生物合成调节机制（如下图所示）

1.优先合成：

Met比Thr、Lys优先合成，Thr比Lys优先合成，HD酶活为PS酶活的15倍。

2.AK受Thr+Lys协同反馈抑制。

3.Lys和Leu代谢互锁，PS受Leu阻遏。

4.Thr脱氨酶受Ile的反馈抑制。

5.Hom脱氢酶受L-Met的反馈阻遏。

6.乙酰CoA和取平衡合成。

7.Glu优于Asp合成。

丙酮酸羧化酶

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

天冬氨酸激酶

DDP合成酶

DDP还原酶

高丝氨酸脱氢酶

高丝氨酸激酶

琥珀酰高丝氨酸合成酶

苏氨酸脱氨酶

（三）高产Thr菌株的育种思路

1.切断或减弱支路代谢

（1）切断支路代谢，切断生物合成Lys的分支途径，选育DAP-或Lys-突变菌株；

（2）变换优先合成，使原来优先合成Met变为优先合成Thr,选育Met-突变菌株

2.解除反馈调节

选育抗结构类似物突变株

Lys的结构类似物：

S-2氨基乙基-L-半胱氨酸（简称AEC），α-氯己内酰胺（CCL）,α-氟己内酰胺（FCL）,苯酯基Lys（CBL）,甲基赖氨酸（ML），α-氨基月桂基内酰胺（ALL）,青霉素，杆菌素等。

Thr的结构类似物：

α-氨基-β-羟基戊酸（AHr）,邻甲基苏氨酸（OMT）等

（1）解除AK酶的反馈调节ThrHxr、Allr、AECr、LysHxr、AHVr、MLr、CCLr、CBLr等。

3.增加前体Asp

反馈抑制（调节）并不意味着完全阻止合成反应，通过受控制反应物的底物积累能拮抗性地克服这种抑制，关键酶AK所催化的底物Asp，AK酶的反应速度与底物Asp浓度间的关系曲线呈S型，随着Asp的增多，AK酶和Asp亲和力协同性的增大，根据变构酶S型动力学性质，存在底物对反应速度发生影响的阈值，Asp既是反应底物，又是反应的激活剂，必须控制在阈值以上。

当浓度饱和而达到最大反应速度时，就不在受反馈抑制，因此为了高产Lys应设法增加前体物Asp浓度以抵消抑制物的影响。

（1）选育丙氨酸（Ala-）缺陷

（2）选育Asp结构类似物抗性，AspHxr

（3）设法增强PC酶活性

采用200-500μg生物素/mL激活PC酶

选择在琥珀酸为唯一碳源生长快速的突变株。

FPs

选择丙酮酸激酶缺陷FPs

柠檬酸合成酶活性降低

用乙酰CoA激活PC酶（因为乙酰CoA与Asp之间存在平衡合成）

采用低糖（4-5%）添加方法可激活PC酶

（4）设法增加（强化）Glu的反馈控制，使Glu优先合成

4.切断苏氨酸进一步代谢的途径

由于细胞可以苏氨酸为前体进一步合成异亮氨酸，这就必然会导致苏氨酸积累量减少，为避免苏氨酸被菌体利用，还需要切断苏氨酸进一步代谢的途径，即选育Ile-或IleL突变株或者异亮氨酸缺陷的回复突变株、

5.选育温度敏感突变株，

以乳糖发酵短杆菌等谷氨酸产生菌为出发菌株，30℃下250μg/mLMNNG诱变处理30分钟，分离选育30℃下生长良好，而在34℃不能生长的温度敏感突变株

5.Lys生产菌株的定向选育标记

以谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌等Glu生产菌株为出发菌，通过诱变定向选育获得遗传标记应为：

DAP-＋Lys-＋A1a-+AECR+CCLR+CBLR+AspHxR+Ile-+Met-+tems

（四）采用细胞融合和重组DNA技术选育高产Thr菌株。

（五）发酵条件控制为：

发酵温度为32～35℃，pH为6.5,充分供氧气。