中性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的条件优化闫桂强.docx
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中性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的条件优化闫桂强
中性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的条件优化_闫桂强
生物工程
中性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的条件优化
闫桂强,王文兵,崔凤杰,董英,黄达明,郭文杰,张志才
（1.江苏大学生命科学学院,江苏镇江212013;2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013;
3.安徽古井集团,安徽亳州236820）
摘要:
以dpph·自由基清除率为筛选指标,应用l3）正交设计优化中性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的最适条件,9（结果表明,当温度为45℃,ph8,料液比为5∶100（g/ml）,水解时间4h时,酶解液的dpph·清除率达到93.18%。
由此
可知,在此优化条件下,小麦面筋蛋白的酶解液具有较强体外抗氧化活性,具备深入研究价值。
关键词:
小麦面筋蛋白,中性蛋白酶,抗氧化,dpph·,正交设计
4
1,212,＊2232
optimizationofenzymatichydrolyzedconditionsof
wheatglutenbyneutrase
yangui-qiang,wangwen-bing,cuifeng-jie,dongying,
huangda-ming,guowen-jie,zhangzhi-cai
（1.instituteofbiologicalsciences,jiangsuuniversity,zhenjiang212013,china;
2.schooloffoodandbiologicalengineering,jiangsuuniversity,zhenjiang212013,china;
3.gujinggroup,bozhou236820,china;）
abstract:
basedonscavengingactivitiesofdpph·radical,theenzymatichydrolysisconditionsofwheatglutenby
4
neutrasewasoptimizedwiththeorthogonaldesignl3）.resultsobtainedshowedthattheoptimalconditionsof9（neutrasetohydrolyzethewheatglutencouldbesetasfollows:
t=45℃,ph=8,theratioofsolidtoliquid5∶100（g/ml）,andhydrolysistime4h.underaboveconditions,dpph·radicalscavengingratioofhydrolyzesreachedto93.18%.undertheoptimalconditions,hydrolyzesofwheatglutenbyneutrasehadgoodantioxidantactivityinvitroanditwasvaluableenoughforthefutureresearch.keywords:
wheatgluten;neutrase;antioxidant;dpph·;orthogonaltest
+
中图分类号:
ts201.21文献标识码:
a文章编号:
1002-0306（2009）02-0178-03植物源蛋白质的酶法改性目前受到广泛关。
采用不同蛋白酶对蛋白质进行酶解,使其结注
构较大幅度重排,导致一些原来包埋在蛋白质分子内部的疏水区外露在溶剂中;同时还可生成不同分子量的肽段,从而使得蛋白质酶解产物的水溶性、结
[3,4]
构性质以及生物活性等功能呈现显著改变。
小麦面筋蛋白又称谷朊粉,是小麦淀粉加工后的副产品。
其蛋白质（主要是麦醇蛋白和麦谷蛋白）含量在70%以上,且氨基酸组成比较齐全,是营养丰富、物美价廉的植物源蛋白质。
小麦面筋蛋白作为改良剂,已在食品加工等方面起到了较好的效果,但由于其含有较多的疏水性氨基酸,分子结构中疏水作用区域较大,因此其溶解度较低,从而使得应用范围受
[6]
到限制。
为充分开发小麦面筋蛋白,扩大其应用范
[5]
[1,2]
2
3
2
1,2
1
2,＊
2
围,可考虑采用酶法改性提高其功能性,拓宽其使用范围,以提高附加值。
对此,我们已通过12种不同种类或不同来源的蛋白酶对小麦面筋蛋白进行水解,对小麦面筋蛋白进行酶解改造,除了酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶（精）能有效降解小麦面筋蛋白之外,中性蛋白酶水解液体外抗氧化活性也具有一定的活性。
近期重复性实验结果表明,其降解小麦面筋蛋白后酶解液抗氧化活性也较高。
由于之前采用的条件并非针对本实验的底物小麦面筋蛋白,因此,本文在前期工作的基础上,结合厂家所提供的酶解条件,以酶解液的dpph·自由基清除率为指标,通过单因素实验和正交实验对中性蛋白酶水解条件进行较系统的优化,以期确定中性蛋白酶对小麦面筋蛋白水解产生抗氧化活性的最适条件。
[7]
1材料与方法
收稿日期:
2008-04-16＊通讯联系人
作者简介:
闫桂强（1983-）,男,硕士研究生,研究方向:
食品生物工程。
基金项目:
国家高技术研究发展计划项目（863计划）（2007aa10z323）;
江苏省教育厅自然科学基金（07kjd350034）;江苏大学高级人才基金资助项目（07jdg020）。
1.1实验材料
小麦面筋蛋白（谷朊粉）安徽古井集团提供,
经凯氏定氮测定其蛋白含量为73.37%;中性蛋白酶南宁东恒华道生物科技有限责任公司,10万u/g;其它试剂均为分析纯。
02
生物工程
1.2实验方法
1.2.1小麦面筋蛋白的酶解过程准确称取定量的小麦面筋蛋白,加入100ml去离子水,搅拌均匀;调节其ph至指定值,分别加入蛋白酶0.05g,恒温水浴反应若干小时。
反应结束后95℃灭酶活,调节溶液ph至7.0,冰浴10min,4℃,10000r/min离心20min,取上清液,冷藏待测。
[7～9]
先测量1.2.2dpph·自由基清除率的测定
dpph·溶液与无水乙醇1∶1混合时的吸光度a再c;测量待测液与无水乙醇1∶1混合时的吸光度aj,最后测待测液与dpph·溶液1∶1混合时在517nm处吸光度a,按照下式计算清除率:
i
aai-j
）×100%清除率%=（1ac
式中:
apph·+无水乙醇;ac为di为待测液+dpph·;a无水乙醇。
j为待测液+
1.2.3正交设计实验以dpph·自由基清除率为考察指标,选取溶液温度、ph、酶解时间、料液比四因素做单因素实验,确定不同因素较适的水平范围。
在单因素实验结果的基础上,每个因素各取三
34）正交设计实验确定中性蛋白酶个水平,采用l9（水解小麦面筋蛋白的优化工艺条件。
[10,11]
食品工业科技
vol.30,no.02,2009
图2ph对小麦面筋蛋白酶解液
dpph·抗氧化能力的影响
2.1.3料液比对小麦面筋蛋白酶解液抗氧化能力的
影响不同料液比对酶解产物dpph·自由基清除率的影响如图3所示。
当料液比为5∶100（g/ml）时,dpph·自由基清除率基本达到最高,为90%左右;料液比5∶100（g/ml）时,清除率基本趋于平缓,甚至有一定降低,可能是由于当底物浓度达到一定程度时,几乎所有的酶分子都与底物结合,出现“饱和”现象,再增加料液比不利于水解,而且还有一定程度的抑制作用。
2结果与讨论
2.1各单因素条件对小麦面筋蛋白酶解液抗氧化能力的影响
2.1.1温度对小麦面筋蛋白酶解液抗氧化能力的影响图1为不同酶解温度对酶解产物dpph·自由基清除率的影响,由图可知,当温度达到45℃时,dpph·自由基清除率为最大值,达到85%左右;而温度过低时,dpph·清除率较低,表明低温不利于该酶降解小麦面筋蛋白;温度过高时,特别是在温度大于50℃时,酶解液dpph·清除率快速下降,表明温度过高已导致酶变性。
图3料液比对小麦面筋蛋白酶解液
dpph·抗氧化能力的影响
2.1.4酶解时间对小麦面筋蛋白酶解液抗氧化能力的影响图4为不同酶解时间对酶解产物dpph·
自由基清除率的影响,当酶解时间达到3h时,dpph·自由基清除率基本达到最高,为82%左右;时间小于3h时,清除率上升明显,表明时间过短,蛋白酶水解底物不完全;当时间大于3h时,清除率趋于平缓,并呈下降趋势。
图1温度对小麦面筋蛋白酶解液dpph·抗氧化能力的影响
2.1.2ph对小麦面筋蛋白酶解液抗氧化能力的影响图2为不同ph对酶解产物dpph·自由基清除
率的影响,当ph达到7时,dpph·自由基清除率较高,为70%左右;酸性条件下,清除率较低,表明偏酸条件会影响中性蛋白酶的活性;碱性条件下,尤其是当ph>8时,清除率有上升的趋势,可能是由于在碱性条件下,小麦面筋蛋白的溶解性增强,或部分蛋白已水解为小分子肽。
同时平行实验结果（不添加蛋白酶,其余条件不变）表明,随着反应体系ph的增大,小麦面筋蛋白的溶解性显著增加,且溶液的dpph·自由基清除率也逐渐提高。
图4酶解时间对小麦面筋蛋白酶解液
dpph·抗氧化能力的影响
2.2正交实验方差分析结果
2.2.1因素水平表根据以上中性蛋白酶水解小麦面
筋蛋白单因素（酶解温度、ph、料液比、酶解时间）结果分析,确定正交设计中各因素的相应水平,如表1所示。
2.2.2正交实验结果正交实验设计结果表略,根据实验结果,进行直观分析和方差分析。
（下转第183页）
02期
工艺技术
表3方差分析结果
方差来源
abc误差abc误差
偏差平方和s412a=148.s413b=101.s.346c=35s.77e=13s27.828a=s.600b=88s6.908c=s.45e=0
自由度
22222222
f比10.7787.3652.56762.395198.65515.489
食品工业科技
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透光率方差分析
f临界值9.0009.0009.0009.0009.0009.000
显著性水平
＊
de值方差分析
＊
＊＊
时间均为显著因素。
综合考虑透光率和de值,最终确定液化条件的最优组合为:
液化温度为100℃,酶用量为24u/g,液化时间70min。
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1～4.
3结论
玉米葡萄糖全糖粉液化关键技术的最优工艺参数为:
玉米粉粒度60目,玉米粉浆浓度25%,无水氯
化钙含量0.1%,加酶量24u/g淀粉,ph5.9,液化温度100℃,液化时间70min;本研究为开发一种绿色、高效、低成本的玉米葡萄糖全糖粉奠定了基础。
参考文献:
（上接第179页）
表1因素水平表
因素
a酶解温度b酶解c料液比d酶解时间
（℃）ph（g/ml）（h）
13563∶100224574∶100335585∶1004根据直观分析和方差分析的结果可得出,影响酶解液dpph·清除率的各因素依次为:
c>b>d>a。
其最优组合为:
a温2b3c3d3,即最适工艺条件为:
水平
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02期度45℃,ph8,料液比为5∶100,水解时间4h。
2.2.3验证实验以最适工艺条件:
温度45℃,ph8,料液比为5∶100（g/ml）,水解时间4h,测定3次小麦面筋蛋白对dpph·自由基的清除率,进行验证实验,结果为93.18%,达到较高的清除率。
3结论
本文主要以dpph·自由基清除率为指标,考3.1察不同作用条件对中性蛋白酶水解小麦面筋蛋白效率的影响,确定出其最适作用条件为:
温度45℃,ph8,料液比为5∶100（g/ml）,水解时间4h,在此条件下,小麦面筋蛋白酶解液dpph·自由基清除率达到93.18%。
3.2从本实验的结果可以看出,小麦面筋蛋白在中
性蛋白酶的优化条件酶解后得到的混合液具有很强的dpph·自由基清除率,即体外抗氧化效果十分显著。
接下来将对酶解液进一步分离纯化,为小麦面筋蛋白的综合利用和开发提供一定的基础。
参考文献:
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