Ion torrent De novo测序文库构建方法 Denovo library.docx

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IontorrentDenovo测序文库构建方法Denovolibrary

Denovo测序文库构建方法

一、Denovo测序的原理

Denovo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。

利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。

Denovo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。

拟构建200bp和400bpIon测序文库，以及Ionmate-pair测序文库。

二、文库构建技术路线

1.Ion200or400-base-readlibrary

Workflow

基因组DNA提取

↓

OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量

↓

超声波打断

↓

末端修复

↓片段纯化

接头连接

↓纯化

文库片段筛选（E-Gel胶回收）

↓

文库片段扩增

↓纯化

Agilent检测，Qubit定量

↓

OneTouch、ES

↓

上机测序

2.Ionmate-pairlibrary

基因组DNA提取

↓

基因组定量检测

↓

DNA破碎（HydroShearDNAShearingDevice）（压力挤压破碎大片段DNA）

↓

末端修复

↓

文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）

↓

文库片段定量

↓

MP接头连接（SOLiDMP接头连接试剂盒）

↓纯化

Qubit定量

↓

确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同）

↓

DNA片段环化

↓

分离纯化环状DNA

↓

定量

↓

环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化

↓

T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切

↓纯化

末端修复

↓

文库片段于链霉素亲和素微珠相连

↓

连接Ion接头

↓

缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数）

↓

片段扩增

↓SOLiD试剂盒纯化

片段切胶回收

↓

Agilent检测

↓

Q-PCR定量

↓

文库构建完成

三、文库构建用到的试剂盒

IonLibraryAdaptorsandPrimersand5500SOLiDMate-PairedLibraryKit

Mate-PairedLibraryEnzymeModule

Mate-PairedLibraryAmplificationModule

Mate-PairedLibraryOligomodule

LibraryMicroColumnPurificationKit

AgencourtAMPureXP60mLKit

Qubit2.0Fluorometer及相应的试剂

Agilent2100及相应的试剂

四、400bp测序文库构建步骤

1.细菌基因组DNA的提取

要求客户提供足量菌体。

将培养至对数期的菌液分装到2-3支2mL离心管，采用适当的转速离心使菌体沉淀到管底，除去上清液，迅速放入液氮速冻后，放入装有干冰的保温盒内运送。

细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。

取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。

提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。

通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。

2.DNA片段化

采用CovarisSystem超声波打断仪（CovarisM220），将待测DNA打断

步骤：

1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg

2）打开CovarisM220安全盖，将CovarisAFA-gradeWater充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色

3）将待打断DNA装入EpLoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入LowTE至总体积为50mL

4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子

5）选择Ion_Torrent_400bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”

6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中

3.末端修复及接头连接

3.1末端修复

使用IonPlusFragmentKit进行，以100ngDNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s

步骤：

1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL

2）向体系中加入20μL5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL

3）室温放置20min

3.2片段纯化

片段纯化使用AgencourtAMpureXPKit进行

步骤：

1）加入180μLAgencourtAMpureXPReagentbeads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min

2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清

4）重复第三步

5）用20μL墙头小心吸去多余的液体

6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

7）取下离心管，加入25μLLowTE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合

8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mLEP管中（不可吸到磁珠）

9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接

4.接头连接、缺口修复和纯化

片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头

4.1接头连接

在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例）

DNA25μL

10×LigaseBuffer10μL

IonP1Adaptor2μL

IonXpressBarcodeX+2μL

dNTPMix2μL

Nuclease-freewater49μL

DNALigase2μL

Nickpairpolymerase8μL

Total100μL

将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增

25℃15min

72℃5min

4℃hold

循环×1

立即转移至一个新的1.5mL离心管中

4.2纯化

片段纯化使用AgencourtAMpureXPKit进行

步骤：

1）加入140μLAgencourtAMpureXPReagentbeads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min

2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清

4）重复第三步

5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体

6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

7）取下离心管，加入20μLLowTE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合

8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mLEP管中（不可吸到磁珠）

5.文库片段筛选

方案1

E-GelAgaroseSystem

采用E-GelSizeSelect2%AgaroseGel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。

主要步骤：

1.上胶将E-Gel系统包含的2%Agarose凝胶安装到基座上

2.点样胶孔内加入250ng的DNALadder、1μgDNA文库

3.电泳打开电源，设置电泳时间，开始电泳

4.片段回收根据Ladder选择需要回收的片段切胶回收

5.片段纯化

方案2

采用琼脂糖凝胶电泳，胶回收法

步骤：

制备1%琼脂糖凝胶

1）称取0.7g琼脂粉置于锥形瓶中，加入70mL1×TAE

2）锥形瓶放置于微波炉中加热至融化，取出，将融化的凝胶转移至凝胶区专用的100mL小烧杯中，向小烧杯中加入35μL0.5μL/mL的EB（或其他染色物，如goldview，duRed等，使用浓度和用量各不相同）

3）将染液充分混匀，倒入装有制胶板且插上了梳子的胶槽中，待凝胶冷却后，轻轻拔下梳子，将装有凝胶的制胶板放入到电泳槽中，其中电泳槽内装有1×TAE缓冲液，没过胶约1~2mm

4）加样。

向装有20μL的片段化DNA离心管中加入2μL的6×loadingbuffer，将离心管内的DNA溶液转移到胶孔中，同时在于凝胶间隔的位置点入3~5μLDL1000marker

5）120V电泳15~20min，蓝色条带到距离另一侧边缘1~2cm时停止电泳

6）将凝胶放置到切胶仪上，在紫外灯下迅速将400bp左右的片段切胶回收

7）使用胶回收试剂盒，按照说明书操作步骤，实现400bp左右大小文库片段的筛选

6.文库片段扩增

6.1100ng文库PCR体系

扩增采用IonPlusFragmentLibraryKit

体系包括：

PlatinumPCRSuperMixHighFidelity100μL

LibraryAmplificationPrimerMix5μL

文库片段25μL

Total130μL

放入PCR仪中，按以下循环进行：

95℃5min

95℃15s

58℃15s8个循环

70℃1min

4℃hold

6.2扩增产物纯化

1）体系中加入195μLAgencourtAMpureXPReagent

2）上下震荡5次，瞬时离心后室温放置5min

3）将离心管放置于DynaMag-2磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

4）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清

5）重复第四步

6）瞬时离心后，放置于磁力架上，用20μL墙头小心吸去多余的液体

7）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

8）取下离心管，加入20μLLowTE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合

9）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mLEP管中（不可吸到磁珠）

10）将转移的离心管放置到磁力架上至少1min，将上清液小心转移到一支新的1.5mL离心管中

7.AgilentTest&QubitQualify

片段大小在400bp左右，片段浓度不低于1μL/mL

五、IonMate-Pair文库构建步骤

1.细菌基因组DNA提取、检测

2.DNA片段化

使用HydroShearDNAShearingDevice对基因组DNA进行片段化处理，将DNA断裂为3kb或10kb大小的片段。

原理：

通过压力作用，使DNA通过中间的孔口，使之断裂

步骤：

1）3kb片段在一支1.5mL离心管中加入5μLDNA和150μL无核酸酶水

5kb片段在一支1.5mL离心管中加入20μLDNA和150μL无核酸酶水

2）在EditWashSchemeTab上，进行以下设置

2轮WS1（0.2NHCl）

2轮WS2（0.2NNaOH）

3轮无核酸酶水处理

3）设置完仪器参数，运行片段化程序

4）运行清洗程序

5）使3kbDNA文库总体积小于70μL，10kbDNA文库总体积小于100μL

3.末端修复（以3kb文库为例）

按照以下体系配置

DNA片段＜67μL

5×ReactionBuffer20μL

10mMdNTP4.0μL

EndPolishingE14.0μL

EndPolishingE25.0μL

Nuclease-freeWatervaries

Total100μL

室温下（25-30℃）放置30min

向体系中加入

20%SDS8.5μL

10×BlueJuiceGelLoadingBuffer10.0μL

65℃水浴10分钟

冰上放置5分钟后，加入胶孔中进行琼脂糖凝胶电泳

4.片段切胶回收

使用1%琼脂糖凝胶分离3kb片段文库，使用0.6%琼脂糖凝胶分离10kb片段文库。

使用1×SYBRSafeGel染色剂，1×TAEbuffer

1×TAE200mL

Agarose2gfor1%geland1.2gfor0.6%gel

10000×SYBRSafegelstain20μL

Total200mL

低电压（5v/cm）电泳过夜

切胶回收

1）在SafeImager蓝光底座上切胶。

3Kb片段选取ladder2.8-3.5kb的片段，10kb片段选取Ladder10-11kb片段。

如果胶块体积过大，切成小块。

2）使用SOLiDLibraryQuickGelExtractionKit进行片段回收纯化

胶块＜200mg，使用1.5mL离心管溶胶

步骤

a.向离心管内加入30μLGelSolubilizationBuffer（L3）/每10mg凝胶

b.混匀，震荡，室温下静置15min，待凝胶溶解（不可高温水浴）

c.按照每10mg凝胶加入10μL异丙醇的比例，向体系中加入异丙醇

3）按照每支分离柱分离400mg凝胶的量，或者分离小于2000μL混合液的比例，将上述混合液加入到分离柱上，室温下12000r/min离心1分钟，弃去液体，将柱子放到离心管中

4）洗柱子

向柱子中加入500μLWashBuffer（W1），12000r/min室温离心1min，弃去液体，开盖离心2分钟，除去多余的乙醇

5）收集DNA

将柱子转移到一支新的1.5mL离心管，加入50μLElutionBuffer，室温下放置10分钟后，12000r/min室温离心1分钟，离心管中包含纯化的DNA片段

5.片段定量

使用Qubit2.0对纯化的DNA片段进行定量

6.DNA与MP接头连接

6.1.计算需要加入的接头量Y（μL）：

Y=106/660/平均片段长度×DNA质量（μg）×50/25

=106/330×DNA质量（μg）/平均片段长度

如Y＜1μL，则加入1μL接头到体系中

6.2体系

末端修复的DNA＜60μL

5×ReactionBuffer20μL

MPRAdaptor（ds）,25μMYμL

MPLAdaptor（ds）,25μMYμL

T4DNA聚合酶，5U/μL10μL

无核酸酶水Variable

Total100μL

室温下放置30min

6.3片段纯化

6.3.1制作磁珠悬液

样品溶液100μL

无核酸酶水150μL

AgencourtAMPureXPReagent200μL

Total450μL

旋窝震荡混匀15s，瞬时离心

室温（20-25℃）下，放置5min

将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液

6.3.2将结合有DNA的磁珠清洗两遍，过程中保持装有磁珠的离心管在磁力架上

加入600μL70%乙醇于离心管中，不震荡磁珠

保持离心管在磁力架上至少1min，小心除去上清

6.3.3将离心管从磁力架上取下，瞬时离心后，将离心管放回磁力架，使用20μL小枪头除去上清液

6.3.4打开离心管盖，室温（20-25℃）风干不超过3min

6.3.5洗脱DNA

将离心管从磁力架上取下，加入50μLElutionBuffer（E1）

旋窝震荡15s，瞬时离心，室温下（20-25℃）放置3min

将离心管再次放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清

将上清液转移到一支新的1.5mLLoBind离心管

6.4Qubit定量分析

如果纯化的DNA含量＞初始DNA总量的5%，则可进入下一步。

如果纯化的DNA含量＜初始DNA总量的5%，也可进入下一步，但在后续的纯化步骤中为了最小化地减少DNA损失量，应该重新确认一开始DNA片段的长度，建议增加或减少10%的插入片段长度。

如果纯化的DNA含量小于50ng，重新开始DNA样品的定量以及mate-pair文库构建初始步骤。

7.通过分子内杂交环化DNA

Mate-paired接头包括一个阻塞寡核苷酸来保护3’端MP接头自连接。

环化时，热变性使阻塞寡核苷酸移除。

DNA分子内杂交环化必须在低浓度条件下进行。

7.1加热块中所有的孔中都加入水，预热至70℃

7.2计算环化反应的总体积（μL），因此根据已知的DNA浓度和体积，将最终的浓度定量为0.5ng/μL

T=[DNA]×V/0.5

如：

DNA=5ng/μL，V=50μL，则T=500μL

7.3体系

DNAvμL

10×Plasmid-SafeBufferT/10.0μL

Nuclease-freeWaterT-（T/10）-VμL

TotalTμL

7.4将体系放置到加热模块中70℃，5min，然后将体系放置到冰上，3kb体系5min，10kb体系30min

8.分离环化DNA

使用Plasmid-SafeDNase除去非环化DNA。

处理过后，使用AgencourtAMPureXPReagent进行纯化

8.1配置下面的反应体系，其中T为环化DNA的总体积

环化DNA体积TμL

ATP，100mMT/100μL

Plasmid-SafeDNase，10U/μLT/100μL

混合反应液，37℃保温40min

8.2片段纯化

8.2.1使AgencourtAMPureXPReagent磁珠再悬浮

8.2.2将DNA结合到磁珠上

a.准备磁珠

样品体积TμL

磁珠稀释buffer0.7×TμL

AgencourtAMPureXPReagent0.3×TμL

b.旋窝震荡15s后，瞬时离心

c.室温下（20-25℃）放置5min

d.将磁珠放置到磁力架上1min以上，至溶液澄清，小心除去上清

8.2.3洗涤DNA2次，每次洗涤时，将离心管放置到磁力架上

a.向体系中加入600μL70%乙醇，不混动磁珠

b.将离心管保持在磁力架上至少1min，小心除去上清

8.2.4将离心管取下，瞬时离心后，放回到磁力架上，用20μL枪头小心除去上清

8.2.5打开管盖，室温（20-25℃）下放置3min

8.2.6混合

无核酸酶水84μL

NickTranslationBuffer10.0μL

8.2.7洗脱DNA

a.将离心管从磁力架上取下，加入91μLNickTranslationBuffer的pre-mixedsolution于装有DNA的离心管中

b.轻轻混合15s，瞬时离心，然后室温下放置3min

c.将离心管放置到磁力加上至少1min，至溶液澄清

d.将上清转移到一支新的0.2mLPCR管中

注意：

立即进行下一步骤

定量：

如果3kb文库的初始DNA量为1-2μg，10kb文库的初始DNA量小于15μg，则跳过定量步骤，立即进行下一步操作。

否则，使用Qubit2.0进行定量。

9.环化DNA缺口转化

使用E.coliDNA聚合酶Ⅰ将环化DNA缺口转化为基因组DNA区，环化目标区域大小可通过反应温度和时间控制。

为了方便实验步骤，不同的mate片段大小采用不同的反应时间但相同的反应速度进行。

9.1环化DNA缺口转化

注意点：

DNA聚合酶Ⅰ对温度变化敏感，因此在反应前先将DNA聚合酶Ⅰ放置到5℃条件下数分钟

a.向0.2mLPCR管中加入以下组分

DNAse-treated，纯化DNA90μL

10mMdNTP5.0μL

b.混合体系后，瞬时离心

c.将体系放置到PCR仪上5℃，2-3min，不加入DNA聚合酶，不打开热盖

d.在另一支0.2mL离心管中加入5.0μLDNA聚合酶Ⅰ，瞬时离心

e.将DNA聚合酶Ⅰ放置到PCR仪上5℃，大于1min，不打开热盖

f.计时器设置10min

g.将DNA聚合酶Ⅰ混合到体系中，轻轻吹打混匀，瞬时离心，放回到PCR仪中

h.开始计时

i.准备400μL含异丙醇的BindingBuffer（B2-S）于一支1.5mL离心管中

j.0.2mL离心管混合体系孵化结束后，立即将混合液转移至1.5mL包含BindingBuffer的离心管中，BindingBuffer能使酶失活，终止反应。

9.2使用SOLiD柱式文库纯化试剂盒纯化DNA

9.2.1将空柱子放置到离心机上10000r/min，预离心1min，离心后的柱子盖子关闭

9.2.2将DNA装到分离柱上

a.将缺口转化的DNA和混有异丙醇的BindingBuffer充分混合

b.将所有的混合液加入到分离柱上

c.室温下10000r/min离心1min，取出液体，环化DNA保留在柱子底部

9.2.3洗涤分离柱

a.将分离柱放回到原先的离心管中

b.加入650μL加入乙醇的WashBuffer（W1）于分离柱中

c.室温下10000r/min离心1min，弃液体

d.14000r/min离心除去剩余的洗脱液

9.2.4洗脱DNA

a.将分离柱转移到一支新的1.5mL离心管

b.加入25μLElutionBuffer（E1）于分离柱正中心，将DNA洗脱，保持分离柱竖直1min

c.室温下14000r/min离心1min

d.将离心的液体重新加入到分离柱上，保持分离柱竖直1min

e.室温下14000r/min离心1min

9.2.5必要时，将纯化的DNA转移到一支新的1.5mLLoBind离心管中

10.使用T7核酸外切酶和S1核酸酶对DNA进行酶切

10.1使用T7核酸外切酶进行酶切

10.1.1体系

DNA25μL

10×Buffer45.0μL

T7核酸外切酶2.0μL

无核酸酶水18.0μL

Total50μL

10.1.2将体系混合后37℃温浴15min

10.1.3将体系放置到70℃下20min，使T7核酸外切酶失活

10.1.4冰上放置5min

10.2S1核酸酶处理

10.2.1使用S1NucDi