植物生物技术复习提纲13.docx

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植物生物技术复习提纲13

植物生物技术复习提纲

第一章绪论

1、现代生物技术的产生及其主要领域

1.1现代生物技术的产生

1）传统生物技术阶段

2）近代生物技术阶段

3）现代生物技术阶段

1953，DNA双螺旋发现；

1961~1966，遗传密码破译；

1972~1974，重组DNA技术建立。

一般认为，1972年DNA重组技术的建立，标志着现代生物技术的诞生。

现代生物技术（ModernBiotechnology）：

即生物技术（Biotechnology），又称生物工程（bioengineering），是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，设计、改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。

1.2现代生物技术的主要技术领域

通常包括：

1）基因工程

2）细胞工程

3）酶工程

4）发酵工

5）蛋白质工程

以基因工程为核心，带动其他“工程”发展。

根据应用领域或技术目的不同，现代生物技术又可分为：

1）农业生物技术:

动物、植物、微生物；

2）医药生物技术；

3）工业生物技术；

4）环境生物技术；

5）海洋生物技术等。

1.3现代生物技术的发展

1）各国概况：

略。

2）现代生物技术发展的三次浪潮：

了解。

3）生物技术发展的重点领域：

未来几年，我国重点领域：

•医药、农业、环境生物技术；

•基础生物学；

•生物多样性和生物安全。

2、植物生物技术的发展与应用

植物生物技术（plantbiotechnology）：

是指对植物的性状（产量、品质、抗性等）进行设计和遗传改造，或利用植物生产次生代谢物质和药物等产品的技术。

包括：

植物组织和细胞培养；植物基因工程；分子标记及辅助育种。

2.1、植物生物技术的发展简史

1）植物组培的奠基和发展

1902，德国Haberlandt，预言植物细胞全能性。

1958，Reinert和Steward，胡萝卜根韧皮部愈伤诱导出体胚，再生植株，证实细胞的全能性。

20世纪60~80年代，脱毒快繁、花药/花粉培养、次生代谢物生产、体细胞诱变与筛选、原生质体培养与融合、种植资源保存等研究热。

我国组培世界领先。

2）植物基因工程的发展

1972：

体外重组DNA分子成功。

1983，首例转基因植物问世。

1996，转基因作物投入商品化生产，此后稳定发展。

至2006，200多种植物获得转基因植株，有些投入商品化生产。

3）分子标记的发展

第一代：

1980s，基于核酸分子杂交，如RFLP。

第二代，1990s，基于PCR或限制酶切+PCR，

如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SCAR、STS等。

第三代，近年来，基于DNA测序，如SNP和EST等。

2.2植物生物技术的应用

1）作物育种。

2）脱毒与快繁。

3）有用物质的生产。

4）种质资源保存与交换。

5）理论研究。

3.转基因作物（GMC）的发展概况

3.1转基因改良的性状

第一代：

抗病、抗虫、抗除草剂。

第二代：

改良品质、增加营养、并有医疗保健功能；抗逆和雄性不育作物。

3.2商业化种植的转基因作物

主要是大豆、玉米、棉花；还有油菜、水稻、苜蓿、番茄、马铃薯、西葫芦、杨树、烟草、辣椒、白菜、香蕉、木瓜、亚麻和康乃馨等。

3.3转基因作物的覆盖率：

略。

3.4商业化种植的国家

2009年25个，前六位是：

美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度和中国。

发展中国家增长快于发达国家。

3.5国内现状

转基因植物研究始于1980`s初。

1993，第一例转基因植物烟草进入大田试验；

2002以来，批准商品化种植的有抗虫棉花、耐储/抗病毒番茄、抗病毒甜椒、改变花色的矮牵牛、抗虫杨树和抗病毒番木瓜。

从跟踪仿制到自主创新、从实验室探索到产业化的转变。

4.植物生物技术的问题与展望

4.1问题

1）安全性问题：

生物安全性：

转基因发生漂移，产生“超级杂草”、破坏当地野生种遗传结构、次生害虫频发、农药用量加大、环境污染等。

食品安全性：

Bt毒蛋白、过敏原、抗生素抗性标记基因等。

4.2展望

农业是生物技术应用最广、最有前景的领域之一。

生物技术可拓展和创新农业功能，为农业发展提供持久而强劲的动力，但它不可能完全替代传统农业技术，后者在农业生产中仍将发挥主导作用。

思考题：

1、生物技术的概念、主要技术领域（内容）及其发展概况。

2、植物生物技术的内容、应用与发展趋势。

第二章植物组织培养的基本理论、条件与操作技术

第一节植物组织培养的基本理论

一、植物细胞的全能性及其表达

1.植物组织培养（Planttissueculture）：

在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。

2.植物细胞的全能性（totipotency）：

一个具有完整细胞核的植物细胞，都拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下能进行表达，具有分化发育成完整植株的潜在能力，称为~。

植物组培诞生的理论基础。

3.植物细胞全能性的表达

全能性的表达：

从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为~。

细胞全能性表达须满足2个条件：

1）脱离整株；

2）营养和激素。

二、植物细胞的脱分化与再分化

1.脱分化（dedifferentiation）:

在组培过程中，已分化的成熟细胞失去原来的结构和功能，恢复为分生状态，经分裂形成愈伤，或只形成未分化细胞特性的过程为~。

分化的逆转。

影响脱分化的因素：

1）脱离母体。

2）生长调节剂。

3）外植体生理状态。

4）基因型

2.再分化/再生（redifferentiation/regeneration）:

由脱分化的愈伤组织或细胞在一定培养条件下重新分化，形成各种组织、器官甚至完整植株的过程。

植物离体再生的途径：

1）器官形成（organogenesis）：

从愈伤组织或外植体形成不定芽、不定根，然后形成完整植株。

2）体细胞胚胎发生（somaticembryogenesis）：

从体细胞诱导的愈伤组织形成类似于合子胚的结构（体细胞胚），进一步发育成完整植株。

也可直接由外植体再生体细胞胚。

三、培养过程中细胞全能性的变化

1.愈伤组织的驯化：

原先依赖于某种生长调节剂而生长的培养物，转变为对该物质自养型的现象。

特点：

无形态发生/再生能力。

2.长期培养物形态发生潜力下降。

第二节植物组织培养的基本条件

一、实验室及其设备

1.准备室

2.接种室（无菌操作室）

3.培养室

4.细胞学实验室

二、培养条件

1.温度：

一般25±2℃。

2.光照：

每日光照12~16h，光强1000~5000lx。

3.湿度：

室内相对湿度70%～80%。

4.氧气。

第三节培养基及其配制

一、培养基的成分

培养基=水+无机＋有机＋激素＋固化剂＋其它

1.水：

蒸馏水、自来水（大规模生产）。

2.无机盐

1）大量元素：

浓度大于0.5mM或100mg/L。

包括N、P、K、Ca、Mg、S。

2）微量元素：

浓度低于0.5mM或100mg/L,一般10-7~10-5M。

包括Cu、Fe、B、MnSO4、Mo、Co、Zn。

3.有机化合物

1）糖：

常用蔗糖。

2）维生素

常用：

VBl（盐酸硫胺素）；VB6（盐酸吡哆醇）；VB3（烟酸）；Vc。

3）肌醇。

4）氨基酸及有机添加物。

一般不用。

5）天然复合物：

椰乳、酵母提取物等，成分复杂，一般不用。

4.植物生长调节物（plantgrowthregulator）

1）生长素类（auxin）

2,4-D常用于愈伤的诱导，NAA常用于生根。

2）细胞分裂素类（cytokinin）

6-BA和KT常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖。

激素作用的模式：

生长素/细胞分裂素的比值决定再分化的方向，该值低可促进芽的分化，而该值高有利于根的分化和形成愈伤，该值适中则利于完整植株的形成。

5.固化剂：

常用琼脂。

二、培养基的pH值

范围5.5~6.0，一般5.8。

三、培养基的渗透压

培养基中的盐类、蔗糖等影响渗透压。

四、常用培养基的种类和特点

1.MS：

无机盐/离子浓度较高，且较平衡，广泛应用。

2.B5：

含较低的铵（常抑制生长），适合于双子叶特别是木本植物。

3.White：

无机盐含量较低，适于生根培养。

4.N6：

成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，用于花药培养。

5.KM-8P：

有机成分复杂，包括多种单糖和维生素，用于原生质体培养。

五、培养基的配制

1.母液的配制

为简便和精确而配，4℃1个月，沉淀或长菌则丢弃。

大量元素：

10~20倍

微量元素：

5000~1000倍

铁盐：

100倍

有机物：

100~200倍

生长调节物质：

1~10mg/L。

配制方法：

略。

2.培养基的配制（略）

灭菌：

高压蒸汽灭菌（1.0~1.1kg/cm2，121℃，20min），24h内完成。

第四节无菌操作技术

一、灭菌方法

1.物理灭菌

1.1高压高温蒸气灭菌（培养基、器皿、用具）：

常用。

在1atm/cm2（0.1Mpa）的压力下，锅内温度达121℃，持续约20min，可杀死各种微生物的营养体及其孢子。

1.2灼烧灭菌（金属器械）

1.3过滤除菌（不耐热物品）

1.4干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）：

不推荐。

1.5紫外线照射灭菌（接种室、超净台用）

2.化学灭菌

2.1消毒剂灭菌：

常用氯化汞、次氯酸钠、次氯酸钙、70%酒精。

2.2熏蒸灭菌。

二、无菌操作技术

在经严格灭菌的超净台或接种室内，使用灭菌的器皿和用品进行操作，叫无菌操作。

是组培的关键技术。

三、外植体的灭菌与接种

外植体（explant）：

从活体植物上切取下来，接种在培养基上进行离体培养的无菌组织或器官。

1.外植体的选择：

重要，考虑多种因素，见教材。

2.外植体灭菌

无菌苗可直接切取外植体和接种。

带菌材料需消毒灭菌，才能切取外植体进行接种。

常用灭菌剂的使用浓度及时间（表略，见教材）

灭菌步骤：

取材切割—自来水冲洗（几分钟至数小时））—70%酒精20~60sec（浸湿表面）—无菌水冲洗—灭菌剂处理—无菌水冲洗—切取外植体—接种。

3.接种

将灭过菌的材料剪切适当大小：

叶片0.5cm2，茎段0.5cm长，茎尖0.2~0.3mm大小，接种于培养基，封口，标名称、日期等，在适宜条件下培养。

四、培养过程中的污染及对策

1.细菌性污染

症状：

接种后1~2d，外植体附近粘液状、泡沫状、混浊、云雾状痕迹。

污染原主要来自外植体。

对策：

严格操作，对外植体彻底灭菌。

2.真菌性污染

症状：

接种后3~8d，外植体附近或培养基上长霉斑。

污染原主要来自空气。

对策：

清洁环境，清洗或更换超净台过滤装置，严格操作。

课后复习与作业：

1.名词解释：

外植体植物细胞的全能性脱分化再分化愈伤组织

2.如何理解植物细胞的全能性？

3.常用培养基的种类及特点？

4.常用的灭菌方法及用途？

5.用高压高温法进行培养基灭菌应注意什么？

6.谈谈你对无菌操作重要性的认识。

第三章愈伤组织的诱导与培养

第一节愈伤组织的诱导与继代培养

愈伤组织的诱导与分化培养是植物组培的基本环节。

愈伤组织（callus）:

指在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

一、愈伤组织的诱导及其形态特征

1.愈伤组织的诱导

1）起动期/诱导期：

外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。

细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。

2）分裂期：

外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞特征，细胞数速增。

3）形成期：

外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。

若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。

2.愈伤组织的形态特征

质地：

松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。

颜色：

白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。

一般，淡黄或淡绿/绿色松脆或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实的愈伤再生能力差。

3.影响愈伤诱导的关键因素

关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。

生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。

二、愈伤组织的继代培养

继代培养（subculture）：

将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。

方法：

一般每3~4周继代1次；每次取生长迅速、浅色、疏松的愈伤进行；继代用培养基与原来相同，或根据培养目标、培养阶段不同而改变成分，通常是改变激素配比。

继代培养的目的：

获得大量优良愈伤，供进一步研究之用。

优良愈伤的特点：

1）疏松易碎和旺盛的增殖能力，以便建立悬浮系或无性系；

2）经长期继代仍保持较强的再分化能力，便于获得再生植株或进行遗传操作。

三、悬浮培养

悬浮培养（suspensionculture）：

将疏松易碎、生长旺盛的愈伤小块放入液体培养基中进行振荡培养，以形成分散性好的游离单细胞和小细胞团的培养技术。

1.悬浮培养的用途

1）提供一个相对一致的细胞群体，供生理生化、胚胎发生、基因表达等研究。

2）次生代谢物质生产。

3）细胞突变体的诱变与筛选。

4）分离原生质体。

2.影响悬浮培养的因素

1）培养基成分；

2）细胞密度；

3）振荡速度；

4）继代时间。

3.悬浮培养物的继代与测定

1）继代培养：

方法略，见教材。

2）细胞增殖的测定：

A.细胞鲜、干重。

B.细胞密实/叠积体积：

每毫升培养液中细胞的毫升数。

C.细胞数。

第二节愈伤组织的分化培养与植株再生

愈伤组织的分化与植株再生通过器官发生和体胚发生两种途径。

一、器官发生与植株再生

器官发生（organogenesis）：

指培养物在适宜条件下产生不定芽和不定根，然后形成完整植株的过程。

又称器官建成/形成/不定器官形成。

1.器官发生的方式/途径

1）直接发生：

从外植体中已存在的器官原基直接形成相应的器官，或者从外植体脱分化形成的分生细胞团上直接形成器官原基。

2）间接发生：

由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤分化成器官原基并发育成器官。

常见方式。

2.器官发生的顺序

1）先芽后根：

常见。

2）先根后芽：

较难诱导生芽。

3）在愈伤不同部位分别形成根或芽，再通过维管组织联系而形成完整植株。

4）仅形成芽或根。

芽是外起源，根是内起源。

3.器官发生的生理与分子基础（了解）。

二、体细胞胚胎发生与植株再生

体细胞胚胎发生（somaticembryogenesis）：

指体细胞培养物在适宜培养条件下形成类似于合子胚的结构，进而发育成完整植株的过程。

经体胚发生形成的类似于合子胚的结构称为体细胞胚或胚状体（embryoid），或不定胚。

花粉胚：

由小孢子或者其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，发育成单倍体植株。

合子胚：

植物通过自然受精作用而形成的受精卵/合子，经历原胚、球形胚、心形胚、鱼类形胚和子叶形胚发育而成的胚。

1.体胚与合子胚的比较

无胚乳或胚乳/子叶发育不良；

无种皮；

物质积累少；

质量差，萌发率低；

一般体胚的干燥和休眠过程短暂或缺乏。

2.体胚发生的方式/途径

1）直接发生：

从外植体切口处或表面直接诱导分化出体胚。

2）间接发生：

从愈伤或悬浮培养的胚性细胞分化形成。

3.体胚发生的生理与分子基础（了解）。

4.胚状体与不定芽的区别及其优点

组织学区别：

1）胚状体有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。

2）胚状体有生理隔离：

其维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往与愈伤或外植体的维管组织相连。

3）胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽无此现象。

体胚再生途径的优点：

1）数量多、速度快、成苗率高；

2）可制成人工种子，便于运输和保存；

3）再生过程简单，遗传性稳定。

4）多数认为体胚起源于单细胞，转基因植株嵌合体少，遗传稳定。

三、影响植株再生的因素

1.外植体：

基因型、来源或生理状态。

2.培养基成分

1）激素：

常用较高细胞分裂素/生长素促进生芽，但有时绝对浓度更重要；将二者配合使用常利于诱导体胚。

2,4-D：

诱导特异基因表达而诱导胚性细胞形成，但在体胚发育中需降低或去除。

细胞分裂素：

对体胚诱导作用不显，但可显著促进体胚成熟，特别利于子叶发育。

2）其他成分

3.培养条件

1）光照：

一般14~16h光照、8~10h黑暗。

2）温度：

接近于植物原产地的温度利于再生。

经验之谈，应根据实验确定。

第三节试管苗的移栽

移栽能否成功是组培应用于实际的重大问题。

一、试管苗与自然苗的区别

1.试管苗角质层/蜡质层薄弱，易失水；

2.试管苗生长势弱，适应性差；

3.试管苗根系很弱，功能差。

二、试管苗移栽时的注意事项

1.要炼苗：

移前加强光照，开瓶塞，使适应外境。

约需1周。

2.选择合适的移栽介质：

先移入人工调配的混合营养土。

3.移栽时洗净琼脂，防止污染。

4.防止伤根。

5.加强栽后管理。

课后复习与作业：

1.愈伤组织的诱导分哪几个时期？

各时期的特点是什么？

2.什么叫继代培养？

为什么要进行继代培养？

3.悬浮培养有何用途？

4.试述植物离体再生的途径（器官发生和体胚发生）。

5.胚状体与不定芽的区别/体胚的特征有哪些？

6.体胚再生途径的优点有哪些？

7.影响植株再生的内外因素有哪些？

8.简述试管苗移栽时的注意事项。

9.名词解释：

胚状体体细胞胚继代培养悬浮培养器官发生体细胞胚胎发生