沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探.docx

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沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探

沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探

【摘要】目的：

探讨精液沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis,CT）感染与精子凋亡的关系，为研究男性不育提供新思路。

方法：

沙眼衣原体的检测用免疫层析法，采用瑞－姬染色精子，观察精子形态变化；用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷酸原位末端标记法检测凋亡精子。

结果：

精液CT阳性组精子凋亡率％，正常对照组精子凋亡率为％，组间差异显着。

结论：

精液CT感染导致精子凋亡率增加，CT感染可能是男性不育的重要原因之一。

【关键词】精子；衣原体,沙眼；细胞凋亡；不育，男性

　　［Abstract］Objective:

ToinvestigatedtherelationshipofChlamydiatrachomatis（CT）infectionwithspermapoptosisthatmightrelatewithmalesterility.Method:

ImmunochromatographymethodwasusedtodetectChlamydiatrachomatis;Conventionalcellmorphologystaining（wrightgimsastaining）,andterminaldeoxynucleotidyltransferaseenzyme（TdT）mediateddeoxynucleotidylinsituandlabeling（TUNEL）wereadoptedforapoptosisdetection.Results:

Spermapoptosisrateswere±%and±%inCTinfectiongroupandnormalfertilitygrouprespectively;Therewasdramaticallydifferencebetweenthetwogroups（）,whichshowedthattheCTinfectionofsemencausedincreaseofspermapoptoticrates.Conclusions:

CTinfectionmightbeoneofthemostimportantcausesformaleinfertility.

　　［Keywords］spermatozoa;chlamydiatrachomatis;apoptosis;infertility,male

　　男性生殖道的感染是引起男性不育的重要的因素，在症状或非症状男性生殖道感染中，起关键作用的两种生物体是解脲支原体（mycoplasmaurealytium;MU）和沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis;CT）。

近年来，关于MU感染与男性不育的关系已有大量的报道，但CT感染对精子及男性不育的影响报道不多[1～3]，CT感染引起男性不育的机制仍不清楚。

据WHO报道，每年全球约5亿人新发性传播疾病，其中的18％是由CT感染造成[4，5]。

在女性中，年轻、性活跃者是生殖道CT感染的好发人群，在CT的传播中具有重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易确定，其原因是CT感染不易作微生物学检查或为无症状者。

细胞凋亡是细胞在胞外或胞内信号诱导下发生的主动自杀死亡过程，是调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。

关于精子凋亡与男性不育的关系已有报道。

为明确CT感染引起男性不育的机制，于2007年对精液CT感染与精子凋亡之间的关系进行了探索。

　　1材料与方法

　　研究对象

　　正常对照组15例，有正常生育史，身体健康，精液CT检测阴性，精液常规正常的自愿捐精子者；年龄24～32岁，平均岁。

CT阳性组57例，不育门诊就诊者，为婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，睾丸、附睾、内分泌、染色体等检查无异常；精液CT检测阳性，年龄24～40岁，平均岁，不育年限2～10年，平均年，其配偶检查无异常。

　　试剂

　　TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司提供，CT快速免疫检测试剂盒由英国Unipath公司提供，1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供，percoll原液由南京凯基生物技术有限公司提供，TritonX100由北京拜尔迪生物公司提供。

　　研究方法

　　所有研究对象均禁欲3～5d，手淫法收集全程精液于无菌玻璃容器中，置于35℃恒温恒湿箱中液化。

取液化后的精液2ml加入底部有2ml45%Percoll液的离心管中，2000r/min离心10min，精液细胞主要沉积于精浆和45％Percoll液之间，于精浆与45％Percoll液之间用移液器取50μl×5次精液沉淀入另一组离心管中，加入2ml生理盐水，充分混匀；1500r/min离心10min弃上清液，加入生理盐水2ml；充分混匀后，1500r/min离心10min，弃上清液，加入生理盐水2ml；充分混匀后，1500r/min，离心10min弃上清液，加入3ml生理盐水，充分混匀，配成一定浓度的细胞悬液。

取制备好的精液细胞悬液50μl分别滴加在普通洁净的玻片和多聚赖氨酸防脱玻片上，用采血针推平，弃去多余的细胞悬液，平放、自然凉干。

　　CT检测

　　取液化后的精液1～2ml，1500r/min离心10min，取沉淀，按照试剂盒说明书进行操作。

　　常规形态学染色

　　取制备好的普通玻片精液细胞样本，浸入瑞－姬染液中1min，倒入等量的PBS缓冲液，再染10min，自来水冲洗，自然凉干后用光学树脂封片，置油镜下检查并拍照。

　　TdT介导的TUNEL法检测凋亡精子

　　取已制备好的多聚赖氨酸防脱玻片精液细胞样本浸入固定液，室温15～25℃固定15min～1h；-20℃的乙醇中放置2h；PBS漂洗3次，每次5min；浸入封闭液，室温15～25℃封闭10min；PBS漂洗3次，每次5min；浸入通透液中，冰上促渗2min。

PBS漂洗两次，样本周围用吸水纸吸干；每个样本滴加50μlTdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min；PBS漂洗3次，样本周围用吸水纸吸干；滴加50μlStreptavidinHRP工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min；PBS漂洗3次；滴加50μlDAB工作液，室温显色反应10min；PBS漂洗3次，光学显微镜下检测及拍照。

　　统计学处理

　　采用SPSS统计软件包进行χ2检验，结果用表示。

　　2结果

　　精子周亡率

　　观察精子头尾部，计数凋亡精子，统计凋亡率，正常对照组精子凋亡率为％，CT阳性组精子凋亡率达到％。

　　TdT介导的TUNEL法检查凋亡精子

　　随机观察正常对照组和CT阳性组精液标本，凋亡精子头部呈棕黄色，核边集、呈新月状或块状小体。

　　3讨论

　　CT是一类专性细胞内生长、有独特发育周期的原核细胞型微生物，很少从正常男性尿道中分离出来，但被认为是非淋菌性尿道炎、附睾炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，其对男性生育功能的影响已引起了人们的关注。

研究结果显示，CT阳性组和正常对照组精子凋亡率分别为％和％，组间差异显着，表明精液CT感染导致精子凋亡率增加。

CT感染可刺激巨噬细胞分泌IL1、LI6及TNFα等细胞因子[7，8]，而TNFα是启动细胞凋亡的重要细胞因子；同时，TNFα增高后使转移单电子的还原型辅图1CT阳性组少精子组。

过量的ROS，一方面可使精子线粒体内、外膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使膜的脂质排列松散，内膜脊减少，ATP合成降低；另一方面过量ROS还可引起精子核的DNA发生断裂，导致精子凋亡的增加。

Darville等研究小鼠生殖道抗CT感染机制，发现在抗CT感染的宿主免疫应答中存在细胞介导免疫。

Spadafora[10]研究证实生精细胞通过CD4分子介导免疫后，具有自发摄取外源性DNA能力，精子与外源性DNA相互作用，刺激内源性核酸导致类似凋亡的细胞死亡过程。

　　细胞凋亡（apoptosis）是多细胞生物普遍存在的细胞死亡形式之一。

有研究显示，在生长发育、组织代谢和一些疾病等许多生理和病理过程中，凋亡都发挥着极为重要的作用。

目前检测凋亡的方法很多,其中原位末端标记技术TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法,可对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

DNA裂解为许多单或寡核苷酸片断是细胞凋亡的主要生化标志。

由于正常的、或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，故很少能够被染色[11]。

应用TdT介导的TUNEL法检测正常对照组和CT阳性组精液标本，凋亡精子呈棕黄色，而未凋亡精子不着色。

在应用TdT介导的TUNEL法检测凋亡精子的同时，应用常规瑞－姬氏染色法从另一角度检测凋亡精子，发现凋亡精子核染色质固缩并核周聚集，呈境界分明的新月形或块状小体；胞质起泡，胞质嗜酸性增强等形态结构改变，与熊承良等[12]报道一致。

万长春等[13]研究表明，由于常规形态学方法不能早期发现凋亡细胞核与细胞器的改变,故凋亡细胞百分率常规形态学染色法低于TUNEL法,但二者差异不显着（）。

　　研究表明，精液CT感染导致了精子凋亡率增加，CT感染可能是导致男性不育的重要原因之一。

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