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许海论文
本科生毕业论文
论文题目：
CdSe量子点与Cu/Zn-SOD的相互作用研究
学校：
徐州医学院
院部：
药学院
专业：
药学
学号：
061634139
姓名：
许海
指导教师：
杨冬芝,赵子明
实习单位：
徐州医学院药物分析研究室
论文工作时间：
2010年3月至2010年6月
目录
摘 要：
3
关键词：
3
ABSTRACT:
.3
KEYWORDS:
3
1．材料与方法4
1.1仪器与试剂4
1.2CdSe量子点的合成及表面修饰4
1.3水溶性CdSe量子点与Cu/ZnSOD的链接5
2.结果与讨论5
2.1CdSe量子点的合成、表面修饰及特征5
2.2量子点与Cu/ZnSOD之间的相互作用6
2.3金属离子对量子点荧光能的影响7
2.4量子点与蛋白质作用机理探讨8
2.5与量子点作用后SOD的活性考察9
3.结论10
参考文献：
11
致谢12
CdSe量子点与Cu/Zn-SOD的相互作用研究
实习生：
许海（061634139）徐州医学院药学院药指导老师：
杨冬芝赵子明徐州医学院药学院
摘 要：
量子点与生物大分子相互作用后表现出不同的光学性质，但作用机理尚不明确。
以Cu/Zn超氧化歧化酶（Cu/Zn-SOD）为代表，采用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱研究了巯基乙酸修饰的CdSe量子点与金属蛋白（或酶）的相互作用。
通过考察金属离子、不同稳定常数的金属络合物对量子点光学性质的影响，以及与CdSe量子点作用后，Cu/Zn-SOD活性变化，推测量子点与金属酶之间的作用机制。
关键词：
CdSe量子点；Cu/Zn超氧化物歧化酶；活性
StudyofReactionbetweenCdSeQDsandCu/Zn-SuperoxideDismutase
Student:
Xuhai,SchoolofPharmacy,XuzhouMedicalCollege
Tutor:
YangDongzhi,ZhaoZimingSchoolofPharmacy,XuzhouMedicalCollege
ABSTRACT:
Quantumdots（QDs）canreactewithbiomacromoleculewithdifferentopticalproperties,however,themechanismisnotveryclearuntiluptonow.ChosenCu/Zn-superoxidedismutase（Cu/Zn-SOD）astheobject,theinteractionbetweenthioglycolicacidmodifiedCdSeQDswasstudiedbyspectroscopymethodsincludingfluorescencespectrometry（FL）andultraviolet-visibleabsorption（UV-Vis）.Throughstudingtheeffectofmetalions,metalcomplexwithdifferentstabilityconstantsonopticalpropertiesofCdSeQDsandactivitiesofCu/Zn-SODwithandwithoutCdSeQDs,themechanismbetweenCdSeQDsandmetalloenzymewasobtained.
KEYWORDS:
CdSequantumdots;Cu/Zn-SOD
近年来量子点作为一种很有发展潜力的新型荧光生物探针，在生命科学中的应用受到研究者的极大关注[1,2]。
已经报道的量子点在这个领域的应用大部分集中于荧光探针识别和成像方面，如生物大分子的标记[3]、生物大分子之间的相互作用[4]、生物组织或肿瘤细胞的标记与成像[5]等。
另外，对部分小分子和离子，如TNT、Cu2+、Ag+、CN-等对量子点荧光性质的影响也已展开系列研究[6,7]。
蛋白质（或酶）是生物化学学科中传统、基础的内容。
有些蛋白质分子的亲水表面上常有一些疏水微区，或在分子表面形成一些形态各异的“沟”、“槽”或“洞穴”等结构，一些蛋白质的辅基或金属离子往往就结合在其中。
它们在生命体中起着储存氧等不同的生理功能。
本实验研究了金属酶-铜、Cu/Zn-SOD与CdSe量子点的相互作用，结果表明，量子点与Cu/Zn-SOD作用后，其荧光强度严重淬灭，推测为金属离子与蛋白质作用的协同效应，即单纯蛋白使荧光增强，部分金属离子使荧光淬灭。
对SOD酶的活性考察发现，量子点并没有对其产生明显影响。
本工作为进一步研究量子点与蛋白质等生物大分子之间的相互作用，以及量子点的活体应用提供有益的参考。
1．材料与方法
1.1仪器与试剂
LS-55荧光分光光度计（美国PerkinElmer公司）；UV-2100双光束紫外－可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；DHT-2磁力搅拌加热器（山东鄄城）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；往返气浴恒温振荡器（江苏大地仪器公司）；PHS-3C型酸度计（上海雷磁分析仪器厂）。
液体石蜡（广东汕头市西陇化工厂，化学纯）；油酸（天津市科密欧化学试剂开发中心）；硒粉，氧化镉（国药集团沈阳分公司）；氯仿；巯基乙酸（上海化学试剂公司）；Cu/Zn-SOD（超氧化物歧化酶），罗丹明6G（Sigma），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（鼎国生物试剂公司）。
其它试剂均为分析纯，实验所用水均为三次蒸馏水。
1.2CdSe量子点的合成及表面修饰
CdSe量子点按照文献[8]通过有机相法合成，步骤如下：
取0.5136gCdO粉末加入装有4ml油酸、6ml石蜡的混合液的三口烧瓶A中，取0.0156gSe粉加入含10ml石蜡的三口烧瓶B中，A与B瓶中溶液分别用N2脱氧5min后加热。
A溶液加热至约150℃时，红褐色CdO粉末迅速溶解生成淡黄色澄清溶液。
当B中溶液加热至约170℃时，Se粉开始溶解，温度上升至240℃时，取出1mlA液迅速加入至剧烈搅拌的B溶液中，此时溶液瞬间变为橘黄色，将加热器移出，磁力搅拌自然冷却至室温。
取上述合成的CdSe量子点1ml，加入2ml氯仿，混合均匀后滴入200μl巯基乙酸，振荡反应30min后，5000r/m离心5min。
将沉淀用氯仿洗涤－离心，重复三次，于N2下干燥即得CdSe桔黄色粉末。
称取粉末若干溶于50mmol/LpH7.4磷酸缓冲液（PBS），所得澄清溶液即为巯基乙酸修饰的CdSe量子点。
1.3水溶性CdSe量子点与Cu/ZnSOD的链接
取浓度为0.16mol/L的前述制备的水溶性CdSeQDs50μl，加入200μlPBS缓冲液，调节溶液pH值。
然后加入50μlNHS和不同浓度的Cu/ZnSOD溶液，在空气浴恒温振荡器中37℃下振荡反应30min。
将溶液冷却至室温后测量荧光光谱。
2.结果与讨论
2.1CdSe量子点的合成、表面修饰及特征
改变油酸与Cd的比例以及反应温度、反应时间等其它条件可以合成出不同尺寸的CdSe量子点。
图1为在1.2节中所述条件下得到量子点的荧光发射
（1）及紫外-可见吸收
（2）曲线。
图1CdSe量子点的光谱特性
Fig.1OpticalpropertiesofCdSeQDs
1.荧光发射光谱（λex=340nm）,2.紫外-可见吸收光谱
1.Fluorescenceemissionspectrum（λex=340nm）,2.UV-visabsorbancespectrum
从图中可见所合成的CdSe量子点在570nm具有对称的、半峰宽较窄（约48nm）的荧光发射峰，其紫外可见吸收光谱在560nm具有明显的吸收峰，表明所合成的量子点粒径分布比较均匀。
由紫外可见吸收光谱及荧光激发光谱可以看出量子点的吸收光谱不是单吸收峰，而是很宽范围的连续吸收，所以不同大小的量子点能同时被同一单色光源激发，这一点正是优于普通有机染料分子之处。
2.2量子点与Cu/ZnSOD之间的相互作用
按照1.3节的方法，完成量子点与Cu/Zn-SOD（pI=5.8）的结合。
图2为CdSe
量子点与Cu/Zn-SOD结合前后的荧光光谱图。
图2Cu/Zn-SOD浓度对CdSe量子点荧光强度的影响
Cu/Zn-SOD的浓度1-7:
0,5,10,20,25μg/ml.CdSe浓度:
4mmol/L.
Fig.2EffectofCu/Zn-SODonfluorescenceintensityofCdSeQDs
ConcentrationofCu/Zn-SODfrom1to7:
0,5,10,20,25μg/ml.ConcentrationofCdSeQDswas4mmol/L
从图中可以看出，随Cu/Zn-SOD浓度的提高，量子点的荧光强度明显降低。
本实验室前期研究及文献报道中，与蛋白质或酶相互作用后，量子点的表面缺陷减少从而荧光强度增强[9]。
本实验表现出与文献相反的现象，可能与SOD的本身结构特点有关，Cu/Zn-SOD中的金属离子可能对量子点的荧光性能有一定的影响。
2.3金属离子对量子点荧光能的影响
本实验中CdSe量子点由巯基乙酸修饰后转移至水相，但巯基很容易受空气或其它氧化剂氧化，当有痕量金属离子如Cu2+，Co2+，Fe2+，Mn2+存在时，巯基的空气氧化程度显著提高，这些金属离子可能是反应所需的催化剂。
基于上述理论，实验考查了Cu/Zn-SOD中含有的Cu2+、Zn2+两种离子对CdSe量子点荧光强度的影响。
图3金属离子对CdSe量子点（4mmol/L）荧光强度的影响
Fig.3EffectofmetalionsonfluorescenceintensityofCdSeQDsof4mmol/L
由图3可见，在小于0.1mmol/L（小于人体含量）浓度时，Zn2+对量子点的荧光性能没有产生明显影响。
而Cu2+则表现出对量子点的荧光强烈淬灭。
因此Cu/Zn-SOD与量子点作用后表现出的荧光淬灭现象可能是Cu（II）的影响。
蛋白质中的金属离子是以络合物形式存在的。
为研究金属络合物和金属离子对量子点影响的区别，实验考查了铜离子分别与铜试剂和葡萄糖形成的络合物对量子点荧光强度的影响。
如图4所示，铜离子使量子点的荧光性能发生明显淬灭，与葡萄糖络合后淬灭程度并没有得到改善，而与铜试剂络合后，量子点的荧光强度不再发生变化，甚至有微弱的增强。
这一现象证明，Cu2+等游离金属离子以及与之形成的相对较弱的络合物可以使金属离子充分发挥其对巯基氧化的催化能力，从而导致量子点荧光的快速淬灭；但若络合物稳定性较强，则限制了金属离子的催化活性，量子点本身氧化速度很慢，因此对量子点的荧光不产生影响。
综上所述，在研究量子点与生物大分子间相互作用时，应从蛋白质的结构特性出发，综合考虑简单蛋白和金属离子对量子点的共同作用。
图4Cu（II）存在形式对CdSe量子点荧光强度的影响
Fig.4EffectsofCu（II）formsonfluorescenceintensityofCdSeQDs
2.4量子点与蛋白质作用机理探讨
量子点与金属蛋白结合后表现的性质与蛋白质本身的结构有关。
蛋白质中的金属离子是以络合物形式存在的。
图5Cu/Zn-SOD活性中心示意图.
Fig.5Thediagramofsuperoxidedismutase.
由图5中Cu/Zn-SOD活性中心结构示意图可见，其中的Cu（II）除与His61的咪唑氮配位外，还与His44，His46，His118的3个咪唑氮配位，形成一个扭曲的四方平面构型；Zn（II）则和His69，His75的咪唑氮以及Asp81的羧基氧原子配位。
生物体内Cu（II）大部分以结合形式存在，但其络合强度较与铜试剂结合力弱，因此其中Cu（II）仍然发挥了其催化活性，造成巯基的快速氧化，从而影响量子点的荧光强度。
2.5与量子点作用后SOD的活性考察
为考查量子点对生物大分子的标记性能，实验采用传统的邻苯三酚自氧化法对超氧化物歧化酶的活性影响进行了考察了。
碱性条件下，邻苯三酚在空气中易发生氧化，但加入Cu/Zn-SOD后，其氧化过程减缓甚至停止。
图6邻苯三酚的氧化曲线.
1.邻苯三酚的自氧化曲线；2.Cu/Zn-SOD抑制下邻苯三酚的氧化曲线；3.加入量子点后Cu/Zn-SOD抑制下邻苯三酚的氧化曲线.
Fig.6Theoxidationofpyrogallol.
1.Theoxidationofpyrogallol;2.OxidationofpyrogallolwithinhibitionofCu/Zn-SOD;
3.OxidationofpyrogallolwithinhibitionofCu/Zn-SODinthepresenceofCdSeQDs.
图6为不同条件下邻苯三酚的氧化物吸收曲线图（检测波长为320nm），由图可见在超氧化物歧化酶存在下，邻苯三酚的自氧化受到抑制，氧化产物峰基本不随时间发生变化。
曲线3中的吸收值均比2中的吸收值大，这是因为量子点本身也存在吸收，使得溶液的吸收值整体变大。
但随着时间的延长，两条曲线基本保持平行，邻苯三酚的氧化产物峰也没有发生明显改变，说明Cu/Zn-SOD仍然保持了原有的活性，与量子点链接后，对SOD的生物活性没有产生影响。
3.结论
通过荧光光谱法考查了CdSeQDs与Cu/Zn-SOD之间的相互作用。
结果表明，与Cu/Zn-SOD作用后Cu（II）使QDs荧光发生明显淬灭和非金属蛋白使QDs荧光增强的协同效应。
因此蛋白质（酶）的结构特性是决定QDs与其结合后荧光性质改变的重要因素。
与量子点作用后，Cu/Zn-SOD仍然保持了酶的活性，因此为量子点的在生命科学中的应用拓宽了思路。
参考文献：
[1]XieM,LiuHH,ChenP,etal.CdSe/ZnS-labeledcarboxymethylchitosanasabioprobeforlivecellimaging.ChemCommun,2005,44:
5518-5520.
[2]LanXM,CaoXB,QianWH,etal.LongFe3O4nanowiresdecoratedbyCdTequantumdots:
Synthesisandmagnetic–opticalproperties.J.SolidStateChem.,2007,180（8）:
2340-2345.
[3]马金杰,梁建功,韩鹤友.不同巯基试剂修饰的CdTe量子点与BSA相互作用研究.光谱学与光谱分析,2010,30（4）:
1039-1043.
[4]董薇,葛欣,王宣怡,等.谷胱甘肽包被的CdSe/CdS量子点的直接水相制备及其对人血淋巴细胞的标记成像.光谱学与光谱分析,2010,30
（1）:
118-122.
[5]刘夏,陈丹妮,屈军乐,等.生物相容性量子点的表征及其在细胞标记中的应用.光谱学与光谱分析,2010,30（5）:
1290-1294.
[6]Fernadez-arguellesMT,JinWJ,Costa-FernandezJM,etat.Surface-modifiedCdSequantumdotsforthesensitiveandselectivedeterminationofCu（II）inaqueoussolutionsbyluminescentmeasurements.AnalChimActa,2005,549（1-2） :
20-25.
[7]LiHB,ZhangY,WangXQ.I-Carnitinecappedquantumdotsasluminescentprobesforcadmiumions.SensorActuatB,2007,127
（2）:
593-597.
[8]YangDZ,XuSK,ChenQF,etal.AsimpleorganicsynthesisforCdSandSe-dopedCdSnanocrystals.ColloidSurfA,2007,299（1-3）:
153-159.
[9]杨冬芝,孙世安,陈启凡,等.CdSe量子点与蛋白质的作用研究.激光生物学报,2007,16（5）:
527-531.
致谢
论文终于完成了，此时的我思绪万千，心中有种说不出的激动和感动。
回忆我在徐州医学院学习的四年中，很多点点滴滴都令人难忘。
这四年我不仅学会了药学方面的专业知识，更重要的是学会了很多的人生的知识。
论文的完成，在这期间我要感谢我的指导老师，杨老师。
她为人随和热情，治学严谨细心，始终认真负责地给予我深刻而细致地指导，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。
正是杨老师的无私帮助与热忱鼓励，我的毕业论文才能够得以顺利完成，谢谢杨老师。
同时，论文的顺利完成，也离不开汤老师、高老师、同学和朋友的关心和帮助，我也要感谢他们。
最后，我要感谢我的父母，他们呕心沥血，才有了我学习的机会。
我要珍惜他们的爱，我也要用行动来回报他们。
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