分子生物学基因工程生物化学复习题.docx

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分子生物学基因工程生物化学复习题

1、蛋白质分子（多肽链）的方向性（即：

N末端和C末端）是如何确定的？

答：

由肽键决定即通过氨基酸NH2和氨基酸COOH的脱水缩合，形成了N末端在左，C末端在右

2、什么是多肽链的肽平面？

什么是二面角？

答：

肽平面：

肽键具有一定程度的双键性质，参与肽键的六个原子C、H、O、N、C1、C2

不能自由转动，位于同一平面。

二面角：

一个碳原子相连的两个肽平面，由于N1—C1和C1—C2（羧基碳）两个键为单键。

肽平面可以分别围绕这两个键旋转，从而构成不同的构象。

3、维持蛋白质分子的三级结构有哪几种力？

次级键包括哪几种？

答：

二硫键、（氢键疏水性相互作用力、离子键、范德法力。

）第二小题

4、如何将蛋白质变性？

如何复性？

答：

加热、加乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等；去除上述因素，若变性程度较轻即可复性。

5、伴侣分子有哪两种类型？

其功能如何？

答：

分子伴侣和伴侣蛋白；辅助新生肽链折叠的，催化对形成功能所必需的共价键盘变化

6、人热休克蛋白在新生蛋白质折叠过程的作用是什么？

答：

辅助新生肽链正确折叠

7、膜蛋白分为哪两种类型？

它们各通过何种化学键与膜相结合？

答；外周膜蛋白和内在膜蛋白。

1）共价键2）疏水性相互作用力

8、疯牛病得病因是什么？

蛋白质构象发生改变而凝集使其由可溶性变成不可溶性。

9、蛋白质翻译后需要进行哪些形式的加工才能具有活性？

肽键N末端甲硫氨酸残基的切除，蛋白质前体的酶切修饰以及氨基残基侧链基团的化学修

饰。

10、胃和胰腺分泌的消化蛋白酶的酶原如何加工才能具有活性？

酶切加工

11、什么是蛋白质的可逆磷酸化？

蛋白质的磷酸化和去磷酸化分别由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。

12、什么是蛋白质的靶向输送？

靶向输送的蛋白质的N端通常有何序列？

定向动送送执行功能的目的地的过程；信号肽

13、何谓‘信号肽'？

其结构特点是什么？

信号肽：

分泌蛋白新生肽段N端的一段能被细胞转动系统识别的特征性的序列。

特点：

该序列约为16~30个氨基酸残基分为N端碱性区、疏水核心区及加工区三个区段，紧接其后的是被信号肽酶裂解的点。

14、信号肽识别颗粒（SRP）的组成如何？

其功能是什么？

一分子7S—RNA和6分子蛋白质；功能：

既能识别露出核糖体之外的信号肽并与结合，又能识别内质网膜上的SRP受体。

15、真核细胞蛋白质如何进入内质网？

1）以MRNA为模板，在胞浆游离核糖体上合成多肽链；2）当包括信号肽在内的一段约70

个氨酸残基的多肽链被合成后，SRP与信号肽、核糖体及GTP结合，蛋白翻译暂停；3）SRP引导核糖体—多肽—SRP复合体与SRP受体结合、启动GTP酶活性，水解GTP使SRP解离并再利用，翻译功能恢复；4）核糖体大亚基与ER膜上的核糖体结合糖蛋白结合，锚定在ER膜上，水解GTP供能，诱导跨ER膜通道开放，新生肽链的信号肽插入内质网膜5）

信号肽启动肽链转位，新生肽链通过跨ER膜通道进入内质网腔。

信号肽被信号肽酶切除并降解；6）ER腔内的HSP70消耗ATP，促进新生肽链折叠成空间构象；7）核糖体的大、小亚基及mRNA分离并进入下一轮循环。

16、插入ER膜的第Ⅰ类膜蛋白有哪些信号序列？

信号肽锚定序列

17、决定细胞核蛋白靶向运输和定位的信号序列是什么？

核定位信号

18、泛素的结构特点和主要功能是什么？

标记需要分解掉的蛋白质使之被水解，决定转录方向，模板键和转录效率和组合蛋白结合位点。

1、什么是操纵子？

操纵子的上游调控区主要有哪些调控序列？

各具有哪些功能？

操纵子：

原核基因上游的调控区及下游转录终止信号共同组成的一个基因表达单位；上游调控区主要有启动子和操控基因；功能：

启动子：

结合RNA聚合酶并启动转录；操纵基因：

特异性阻遏物的结合区。

2、大肠杆菌的启动子通常是什么？

-10区、-35区、+1区、

3、6因子的功能是什么？

其主要类型的是什么/？

识别启动子。

628、632、654、670、

4、LAC操纵子调控区有哪些调控序列（结合位点）？

各具有哪些功能？

5、为什么LAC操纵子的阻蛋白能够抑制转录？

由于操纵子元件与启动子有部分重叠阻蛋白与操纵元件结合后，可抑制RNA聚合酶与启动子结合，抑制转录。

6.cAMP是如何产生的？

CAP如何调节lac操纵子的表达？

CAMP是腺苷酸催化ATP产生的，只有CAP结合结合到启动子上游的CAP结合位点后，促进RNA聚合酶与启动子结合才能有这转录。

7.何谓葡萄糖效应？

细菌通常优先以葡萄糖作为能源，当培养环境中有葡萄糖时，即使加入乳糖，阿拉伯糖等糖类，细菌也不用这些糖，不产生代谢这些糖的酶，直到葡萄糖消耗完毕代谢其他糖的酶才会根据相应的糖是否存在被诱导产生，这种现象称为葡萄糖效应。

8.（p）ppGpp的功能是什么？

调节活性大分子的协调性

9.乳糖操纵子如何由CAP和阻遏蛋白共同调控？

10.在trp操纵子中，何谓前导序列？

其结构特点是什么？

11.何谓衰减子？

它在是如何形成的？

其功能是什么？

12.原核生物mRNA翻译起始位点的特点是什么？

AUG上游10个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与16S'rRNA3'端识别

13.mRNA的二级结构如何控制翻译起始？

MRNA的二级结构可隐蔽SD序列，使核糖体无法序列。

14.反义RNA分子是如何产生的？

其功能如何？

15.真核生物基因表达如何在染色质（染色体）进行调控？

各举一例说明。

16.DNA甲基化发生在哪个碱基的哪个位点？

17.DNA甲基化为什么使基因不能表达？

甲基化影响基因表达的机制有下列几种：

直接作用：

基因的甲基化直接改变了基因的构型，影响DNA特异顺序与转录因子结合使基因不能转录；间接作用：

基因5'端调控序列甲基

化后与核内甲基化CG序列结合蛋白结合，阻止了转录因子与基因形成转录复合物。

18.染色质结构如何影响基因表达？

19.何谓顺式作用元件？

何谓反式作用因子?

举例说明。

顺式作用元件：

真核生物基因中的调控序列决定转录起始位点RNA聚合酶转录效应。

反式作用元件：

能直接或间接结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质

顺式：

启动子、增强子、沉默子、衰减子、终止子

反式：

DNA结合蛋白、转录因子

20.真核转录因子的DNA结合结构域有哪几种模体?

每种模体的主要特点是什么？

1）锌指：

借助半脱氨基酸和组氨基与锌离子结合2）间源异型域：

具有螺旋—回折—螺旋

结构3）亮氨基拉链：

使两个单位结合并形成DNA结构域4）螺旋—环—螺旋：

易于形成

二聚体，能与免疫蛋白K链基因增强子结合的反式E12和E17具有这种结构。

21.原核转录调控因子的DNA结合结构域主要是哪一种模体？

22.转录因子的激活结构域的主要特点是什么？

有哪几种模体?

哪种模体的激活能力最强?

23.何谓染色质重塑?

改变染色体位置和结构，改变染色体DNA可接近程度

24.何谓反式作用因子的组合调控?

每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因表达的调控不是由单一因子完成的而是几种因子结合发挥特定的作用。

25.真核pre-mRNA需要进行哪些加工?

真核pre-mRNA需要进行5'端加帽，选择性剪接，3'端加定

26.5'-帽子结构分为哪几种类型?

脊椎动物的帽子结构中有几个甲基？

帽子的功能是什么？

5'-帽子结构分为CAP0、CAPⅠ、CAPⅡ；三个；1）决定mRNA稳定性，2）通过核膜输送3）翻译

27.真核mRNA3'-端多聚腺苷酸化的信号是什么？

poly（A）尾的功能是什么?

poly（A）尾的功能是保护mRNA不受降解

28.为什么tRNA和rRNA分子要比mRNA稳定得多?

tRNA和rRNA有二、三级结构

29.什么是蛋白质同质异形体?

蛋白质同质异形体的功能是否相同？

蛋白质同质异形体：

不同基因翻译表达同一蛋白质；有可能相同有可能不同；

30.人类大约有多少个蛋白质编码基因?

人体内有多少种蛋白质？

为什么一个基因可以编码多种蛋白质？

人类大约有24000左右个蛋白质编码基因，10万种蛋白质

31.举例说明真核mRNA的5'-UTR和3'-UTR如何在翻译水平调解基因表达水平?

32.不稳定的真核mRNA的3'端序列的特点是什么?

以不完全互补的形式结合在3'端AU段，富含AU序列被核苷酸切割易识别

33.线虫编码小分子miRNA（lin-4）如何调解基因（lin-14）的表达?

34.真核基因表达调控有哪几个主要阶段?

1）转录2）转录加工3）mRNA降解4）翻译5）翻译加工6）蛋白质分选7）蛋白质降解

35.何谓基因表达的“统一理伦”?

36.何谓CTD?

CTD的功能是什么？

CTD：

RNAPⅡ最大的亚基C端结构域；功能：

CTDRNA加工过程中起着平台作用通过CTD磷酸化来调整及招募不同pre-mRNA加工因子进行相应加工。

基因工程试卷B

名词解释（每个2分，共20分）

1、转化:

2、质粒转移性:

3、DNA文库:

4、RACE:

5、选择标记基因:

6、降落PCR

7、载体:

8、感受态细胞:

9CaMV35s:

10、ORF:

、选择题（每题1分，共15分）

1（）限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是

A修复自身的遗传缺陷B促进自身的基因重组

C强化自身的核酸代谢D提高自身的防御能力

:

（I内切酶II连接酶III末端转移酶IV聚合酶

A.I+IIB.I+III+IVC.II+III+IVD.I+II+IV+III

4（）限制性内切核酸酶的星活性是指：

A在非常规条件下，识别和切割序列也不发生变化的活性。

B活性大大提高

C切割速度大大加快

D识别序列与原来的完全不同

5（）下列五个DNA片段中含有回文结构的是

A.GAAACTGCTTTGACB.GAAACTGGAAACTG

C.GAAACTGGTCAAAGD.GAAACTGCAGTTTC

6（）关于cDNA的不正确的提法是：

A同mRNA互补的单链RNA

B同mRNA互补的含有内含子的DNA

C以mRNA为模板合成的双链RNA

D以上都不正确

7（）下列有关连接反应的叙述，错误的是

A.连接反应的最佳温度为37℃

B.连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%

C.连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mM

D.连接酶通常应过量2-5倍

8（）T4-DNA

连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段

DNA片段连接在一起，其底物

的关键基团是

A.2'-OH和

5'–P

B.2'-OH

和

3'-P

C.3'-OH和

5'–P

D.5'-OH

和

3'-P

9（）载体的功能是

A.外源基因进入受体的搭载工具

B.不能为外源基因提供整合能力

C.不能提供复制能力

D.不能为外源基因提供表达能力

10（）黏性末端连接法，不仅操作方便，而且

A产生新切点B易于回收外源片段

C载体不易环化D影响外源基因的表达

11（）下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?

A质粒

B黏粒

C酵母人工染色体（YAC）

Dλ噬菌体

12（）考斯质粒（cosmid）是一种

A.容量最大一种载体

B.由λ-DNA的cos区与一质粒重组而成的载体

C.是一种单链DNA环状载体

D.不能在受体细胞内复制，但可以表达

13（）某一重组DNA的载体部分有两个BamHI酶切位点。

用BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的BamHI酶切位点共有

A.4个B.3个C.1个D.2个

14（）下列哪一种酶作用时需要引物?

A限制酶B末端转移酶C反转录酶DDNA连接酶

15用下列方法进行重组体的筛选，只有（）说明外源基因进行了表达。

（a）Southem印迹杂交（b）Northem印迹杂交

（c）Western印迹（d）原位菌落杂交

三、简答题（每题5分，共25分）

1、简述获得目的基因常用的几种方法。

2、什么是α-互补筛选？

3、简述酶切反应体系及反应条件？

4、核酸操作的基本技术有哪些？

5、限制性核酸内切酶有几种类型？

常用是哪种类型并简述其特性。

四、论述题（每题10分，共40分）

1论述重组子的筛选和鉴定常用的方法。

2基因工程基本操作程序。

3试述5′RACE技术原理和方法

4试举例说明基因工程中为什么常用大肠杆菌作为工程菌？

基因工程试题标准答案及评分标准B

一、选择题（每题1分，共15分）

1、D2、A3、A4、D5、D6、C7、A8、C9、D10、C

11、C12、B13、D14、C15、C

二、名词解释（每题2分，共20分）

1、严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程

2、质粒不亲和性：

在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。

3、cDNA文库：

是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的

克隆的集合。

4、RACE：

是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3，或5，端之间未知序列的方法。

5、基因文库：

通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物，组织，器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。

6、RT-PCR:

先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR

7、载体：

指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。

8、S-D序列：

在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3，末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine、Dalgarno发现，故后来命名为

Shine—Dalgarno序列，简称S-D序列。

9、穿梭质粒载体：

指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

10、MCS：

指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片

段。

三、简答题（共25分，每题5分）

1、什么是包涵体？

重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。

包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。

2、什么是α-互补筛选？

质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。

有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。

这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。

3、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？

⑴酶的纯度。

⑵DNA样品的纯度。

⑶DNA的甲基化程度。

⑷酶切反应的温度与时间。

⑸DNA分子的构型。

⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液。

4、核酸操作的基本技术有哪些？

1核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交

5、基因工程诞生的理论基础是什么？

是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。

理论上的三大发现：

1证实了DNA是遗传物质

2揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理

3遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：

①限制核酸内切酶的发现与DNA切割

2DNA连接酶的发现与DNA片段的连接

3基因工程载体的研究与应用

四、问答题（每题10分，共40分）1如何有效地提高外源基因的表达效率？

⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷

高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平：

①调整SD

序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的

代谢负荷：

①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：

①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质

2试述载体构建一般方法

A目的基因分析

（1）ORF分析

（2）酶切位点分析

B载体选择与分析

（1）多克隆位点分析

（2）抗性标记分析（3）启动子与其他筛选标记分析

C连接体系与连接时间确定

3试述5′RACE技术原理和方法

PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术（RACE）。

如果已知mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly（A）尾（3′末端）或附加的同聚尾（5′末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。

为获得5′末端部分cDNA

克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly（A）尾。

通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。

4大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？

优点：

大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。

缺点：

在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。

三、关于酶的组题（答题要简洁，条理清晰，有针对性。

如果你要回答的内容在前面已经给

出，可以采用“参见⋯⋯”的引用方式，以便节省答题时间）

1．

2．

酶为什么具有催化功能？

（4分）

为什么糜蛋白酶（Chymotrypsin）属于丝氨酸蛋白水解酶家族？

你还知道那些丝氨酸蛋白水解酶以及蛋白水解酶家族？

（

4分）

3．

酶为什么具有最适催化温度和pH值？

（分）

4．

糜蛋白酶的催化动力学曲线与肌红蛋白的氧合曲线类似；天冬氨酸转氨甲酰酶个变构酶，它的催化动力学为什

5．

（ATCase）是曲线是否与血红蛋白的氧合曲线类似，么？

（4分）糜蛋白酶的一级结构及其激活过程如图所示，这个激活顺序能否颠倒？

给出理由（分）

6．

对于人工酶（如环糊精）、核酶（RNA）、抗体酶、同工酶、以及具有催化功能的脂类分子集合体等具有明显区别的概念或对象，你能用什么基本原理将他们统一在“催化的旗帜下？

给出理由（4分）

drugthatinhibitsanoverproducedenzyme

III.

Youareworkingonacompoundasapotential

whoseuncontrolledactivityleadstouncontrolledcellproliferation（cancer）.Asteady-statekineticanalysisoftheenzyme-catalyzedreactionwascarriedout,withvelocitiesmeasuredasafunctionoftheconcentrationofthesubstrateintheabsenceandinthepresenceof10nMinhibitor.Theresultsofthekineticsexperimentareplottedforyoubelow.Pleaseanswerthefollowingquestions.（10pts）

1.Whattypeofinhibitoristhiscompound（beasspecificasyoucan）?

Showthediagramoftheinhibitor'smechanism（byEdenotingenzyme,Sdenotingsubstrate,Idenotinginhibitor;forexample:

E+SESE+P）.

2.CalculatetheKm,KcatintheabsenceofinhibitorandKmapp,Kcatappinthepresenceofinhibitor（appdenotingapparent.Thetotalconcentrationofenzymeis2nM）.

3.CalculatetheinhibitorconstantKI.

IV.Lysozymedestroysthecellwallofbacteriabycatalyzingthehydrolysisof1,4-β-linkagesbetweenN-acetylmuramicacid（NAM）andN-acetyl-D-glucosamine（NAG）residuesinapeptidoglycan.Sixhexosesofthesubstratefitintotheactivesiteoflysozyme,adeep