第十四章 临床化学常用分析技术.docx
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第十四章临床化学常用分析技术
第十四章 临床化学常用分析技术
本章考点
1.临床化学常用分析方法
光谱分析、电泳技术、离心技术、层析技术、电化学分析技术的基本原理和应用
2.临床化学方法的建立
（1）方法建立的根据
（2）方法建立的过程
（3）方法的评价
（4）方法建立后的临床观察
第一节 临床化学常用分析方法
一、光谱分析（分光光度技术）
定义：
利用物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。
它具有灵敏、快速、简便等特点，是生物化学分析中最常用的分析技术。
分类：
（一）可见及紫外分光光度法
分光光度法的理论基础是朗伯－比尔定律。
1.Lamber－Beer定律：
A=k·b·c
A为吸光度
k——吸光系数
b——光径，单位：
cm。
c——溶液浓度，单位：
g／L
在可见-紫外分光光度法中，通常在测定未知样品浓度的同时，与同一个已知浓度的标准物作比较，可以利用以下公式计算而求出其浓度,即比较法。
其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。
2.摩尔吸光系数：
在公式“A=k·b·c”中，当c=1mol／L，b=1cm时，则常数k可用ε表示称摩尔吸光系数。
ε的意义是：
当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。
ε是物质的特征性常数。
不同物质的摩尔吸光系数不同
3.比吸光系数：
在公式“A=k·b·c”中，当c为百分浓度（w／v），b为cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。
（二）原子吸收分光光度法
根据待测元素的气态原子能吸收相同原子所发射的特定波长的光，其吸收特性遵循Lambert-Beer定律，即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。
常用的定量方法有：
1.标准曲线法：
将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。
在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。
由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。
2.标准加入法：
把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。
本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响。
3.内标法：
在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。
以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。
本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。
只适用于双通道型原子吸收分光光度计。
（三）荧光分析法
有些物质物质受到有较高能量的光（如紫外光）照射时，在吸收了某些波长的光后，会发射出不同波长和不同强度的光（光致发光），照射停止，发光亦随之消失，这种光称为荧光。
利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法。
在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称为发射光。
荧光分析法测定的是受光激发后所发射的荧光强弱。
在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强。
（四）火焰光度法（火焰发射光谱法）
是待测元素利用火焰作为激发源，成为激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法，属于原子发射光谱分析的一种。
样品中待测元素激发态原子的发射光强度I与该元素浓度C呈正比关系，即I=aC，式中a为常数，与样品组成、蒸发和激发过程有关。
火焰光度法通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。
临床工作中，火焰光度法主要用于体液中的钠、钾测定，钠的特征谱线为589nm（黄色），钾的特征谱线为767nm（深红色）。
（五）透射和散射光谱分析法
主要测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度，常用法为比浊法，又可称为透射比浊法和散射比浊法。
临床上多用于对抗原或抗体的定量分析。
二、电泳分析
在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。
常用的电泳分析方法：
1.醋酸纤维素薄膜电泳：
醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。
这种薄膜对蛋白质吸附小，能消除电泳中出现的“托尾”现象。
具有分离速度快、样品用量小的特点。
适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
2.凝胶电泳：
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子核酸。
琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。
3.等电聚焦电泳：
利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，在区带电泳中分辨率最好。
常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。
4.毛细管电泳：
利用电泳和电渗流的电动力学原理，在一种空芯的微小内径的毛细管中进行混合物的高效分离技术。
毛细管电泳可分为：
毛细管自由溶液区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳及胶束毛细管电动力学色谱。
三、离心技术
（一）离心技术的基本原理
离心技术是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同，用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。
离心技术分为制备离心技术和分析离心技术。
制备离心技术主要用于物质的分离、纯化，而分析离心技术主要用来分析样品的组成。
离心力（Fc）Fc=mω2X
m是质量（g）
ω是旋转角速度（弧度／s）
X是颗粒离开旋转中心的距离（cm）
相对离心力（RCF）：
RCF=1.118×1O-5·n·X
n为转子的转数（rpm）
X为离心转子的半径距离（cm）
（二）离心技术种类及在检验中的应用
1.离心技术在生化检验中的应用主要有两方面：
①对悬浮液中颗粒的分离，如从全血中分离血清、血浆等；
②分离两种密度不同液相，如从有机溶剂和水的混合物中分离出有机相等。
2.种类：
（1）普通离心法：
可用来分离细胞、细胞膜或细胞碎片。
（2）差速离心法（差级离心法）：
原理是交替使用低速或高速离心，也可采用逐渐增加离心速度的办法，通过不断增加相对离心力使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。
由于分辨率不高，常用于定性分离手段之前的粗制品提取。
3.密度梯度离心法：
比差速离心法复杂，但该法具有很高的分辨率，可以同时使样品中的各个组分得到分离。
其做法是将样品放在密度梯度介质中进行离心。
可分为：
1）速率区带离心法：
根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。
离心前在离心管内装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。
离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大。
一般用于分离大小相异而密度相同的物质。
2）等密度区带离心法：
离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶部或与梯度液混合，当梯度液由于离心力作用逐渐形成低浓度而管顶稀的密度梯度，同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。
当管底介质的密度大于粒子的密度时，粒子上浮。
此法常用于分离大小相似而密度差异较大的物质。
4.分析性超速离心
主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，如测定大分子的相对分子量、生物大分子的纯度估计、分析生物大分子中的构象变化等。
四、层析技术
（一）原理
层析法是利用待分离物质不同物质理化性质的差异而建立起来的一种分离分析技术。
所有的层析系统都由固定相和流动相组成。
固定相：
是固体物质或是固定于固体上的成分。
流动相：
由水和各种溶媒组成（液体或气体）。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
（二）层析法分类
而按层析原理还可将层析分为：
1.凝胶层析：
又称分子筛过滤、凝胶过滤或排阻层析等。
固定相是多孔凝胶构成。
根据物质分子大小不同，随流动相通过凝胶时受阻滞的程度（移动速度）不同得以分离。
优点：
所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，不损伤样品；
重复性好，有利于定性；
操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。
常用的凝胶有SephadexG（葡聚糖凝胶）系列。
凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。
液体
气体
液体
固体
液-液层析
液-固层析
气-液层析
气-固层析
2.离子交换层析：
采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
3.高效液相层析（HPLC）：
在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。
具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利，根据流动相和固定相相对极性，高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。
4.亲和层析：
利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：
抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
五、电化学分析技术
（一）基本原理
利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。
（二）离子选择性电极分析法
离子选择电极（ISE）能对某特定离子产生响应，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，因此可用离子选择电极来定量分析某些离子的活度或浓度，临床上常被用于多种体液（血、尿、唾液、脑脊液等）中Ca2+、K+、Na+、Cl-、F-和碳酸氢盐等离子测定。
使用离子选择性电极电位分析法测定的是离子活度a，而一般分析中要求测定的是离子浓度c，二者关系为：
a=f·c，其中f为活度系数，是溶液中离子强度的函数。
。
在稀溶液中活度系数f≈1时，a=c，活度可代表浓度。
高浓度测定时，通常在标准溶液和样品溶液中分别加入浓度很大的对待测离子无干扰的电解质，作为总离子强度调节缓冲剂，使标准溶液与待测溶液离子强度达到一致，并有缓冲及消除干扰的作用。
习题：
发射光谱分析法是下列哪类测定法的原理
A.火焰光度法
B.离子选择电极法
C.化学比色法
D.免疫比浊法
E.放射免疫法
[答疑编号500727140101]
『正确答案』A
2.用于分离不同分子大小的蛋白质的方法是（ ）。
A.琼脂糖凝胶电泳
B.凝胶层析
C.速率免疫比浊法
D.免疫固定电泳
E.普通离心
[答疑编号500727140102]
『正确答案』B
第二节 实验方法的选择
生物化学检验是利用各种检测技术和方法，研究人体组织、体液的各种成分及其含量，为临床疾病预防、疾病诊断、病情监测、疗效评价、预后判断提供准确可靠的信息。
选择准确可靠的实验方法是提供准确可靠信息的重要中心环节之一。
一、实验方法选择的目的
1.各实验室按照方法选择的原则结合自身条件，确定合适的某项目的检测方法。
2.保证拟使用的检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法分析性能及可能引入的误差进行了解，作出初步评估。
二、实验方法的分级
国际临床化学联合会（IFCC）根据分析方法的准确性与精密度的不同，将其分为决定性方法、参考方法和常规方法三级。
（一）决定性方法（definitivemethod）
决定性方法准确度最高、系统误差最小、几乎无干扰的方法。
其测定结果与“真值”最为接近。
主要方法有重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）等。
由于技术要求太高，费用昂贵，因而这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于评价和发展参考方法与一级标准品。
国际上研究这类方法的实验室很少，美国、法国、德国、丹麦等国家有这类实验室。
（二）参考方法（referencemethod）
参考方法是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。
这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。
参考方法能在条件优越的实验室作常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；
用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。
（三）常规方法（routinemethod）
指性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，且经济实用。
其中准确度已经确定即已查明偏差方向和数量的方法称为偏差已知方法，而准确度不明者称为偏离未知方法。
常规方法经有关学术组织认可，可以作为推荐方法，用于常规实验室检测。
三、标准试剂的分级
标准品（参考物）定义：
它是一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实某种测定方法的物质。
标准品是进行方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制等不可缺少的，在临床化学中将其分为三级。
（一）一级标准品（原级参考物）
它是已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经定量。
一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（WBS）颁发证书，并指明其性质和有关数据。
一级标准品用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。
（二）二级标准品（次级参考物）
这类标准品可以是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），也可以存在于相似基质中。
可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。
二级标准品主要用于常规方法的标化和控制物的定值。
（三）控制物
控制物用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。
有定值血清和未定值血清两种。
控制物不能用于标定仪器或方法。
在控制物的制备、定值和使用过程中，应严格按有关规程进行。
”
四、实验方法选择的原则
实验方法选择要从实际出发，根据实验室的条件和检测要求确定适当的方法。
条件优越的实验室应建立和选择参考方法，以利于对常规方法的评价和标准品的定值；
一般临床化学实验室应结合仪器设备、技术力量、实验成本等因素，主要选择常规分析方法和使用方便的参考方法。
选择常规分析方法时，尽量选用国内外通用方法或推荐方法，便于方法的规范化和质量控制，要重点考虑实用性和可靠性两方面的性能指标。
（一）实用性
一般应具备微量快速，方法简便，安全可靠，成本低廉。
1.微量快速便于急诊，适合批量成套分析。
快速即检测速度，是指一份标本操作一次所需时间以及在常规条件下单位时间（小时、天）内所能处理的标本数量。
2.方法简便操作人员无需特殊培训；试剂种类少，最好是单一试剂，易于自动化分析。
3.安全可靠试剂无毒，腐蚀性小，无需特殊防护措施。
4.成本低廉无需昂贵试剂和仪器，每件成本费用与一次分析的标本数量有关，应区别单件标本及不同工作量时的费用。
（二）可靠性
所选方法应具有较高的精密度、准确度和较大的检测范围，保证测定结果的准确性能满足方法允许误差限度的要求。
五、实验方法选择的步骤
（一）广泛查阅文献
先根据方法选择的要求对已发表的各种检测方法进行比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据及真实的使用价值。
（二）选定候选方法
根据实验室的设备条件、人员业务素质、工作量等具体情况，选择适合于本实验室具体条件的方法（候选方法）。
候选方法确定后，应写出该法的原理、参考文献、所用仪器、试剂来源和纯度、标本收集要求、详细的操作步骤、结果计算和分析、参考范围、注意事项等。
（三）候选方法的初步试验（预试）
对候选方法应作初步评价实验。
初步试验包括：
1.标准曲线和重复性；
2.质控血清和新鲜标本的重复试验；
3.分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。
通过对候选方法的初步实验使工作者熟悉有关技术，掌握各分析步骤要点，判断能否适合本室条件要求。
根据初试所获得的资料确定是否有必要作进一步研究。
第三节 实验方法的评价
实验方法评价的过程就是对实验误差的测定。
根据评价实验所测得的结果和方法性能判断的标准，决定该方法是否可以被接受。
一、实验误差
实验误差（简称误差）是量值的给出值与其客观真值之差。
给出值包括测量值、标称值等，具有广泛性。
误差就是测量值与真实值之间的差异。
误差不是错误，在测量时误差是不可避免的。
标本中待测物的真实浓度为真值，它是客观存在的，但在有限次的测定中，不可能求得真值；在实际工作中，采用严格的实验条件和最准确精密的方法，多次重复测定所得的测定值的平均值代表相对意义的真值。
测量次数越多，平均值就越接近真实值。
（一）实验误差的分类
按照来源性质，实验误差可被分为系统误差、随机误差二类。
1.系统误差（systematicerror，SE）
（1）概念：
系统误差是指一系列测定值对真值存在同一倾向的偏差。
（2）特点：
由恒定的因素引起在一定条件下多次测定中重复出现。
具有单向性，而没有随机性，常有一定的大小和方向；
找到引起误差的原因，采取一定措施即可纠正。
消除系统误差能提高测定的准确度。
（3）分类：
（4）引起系统误差主要原因有：
①方法误差：
由方法缺陷导致所致，如特异度不高、标本中干扰物的存在等
这是生化检验中最严重、最难避免的误差
②仪器和试剂误差：
常见于仪器波长未校准，量器不准，试剂质量差等。
2.随机误差：
（randomerror，RE）
（1）概念：
是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时引起的误差。
（2）特点：
误差的大小、方向和正负随机出现，数据呈正态分布；
具有不可预测性，不可避免，但可控制在一定范围内；
分析步骤越多，造成这种误差的机会越多。
增加测定次数误差可降低。
随机误差是由测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变以及分析人员操作习惯等因素的变化而引起。
引起随机误差和系统误差的原因是相对的，有时引起系统误差的因素可以引起随机误差，引起随机误差的因素也可引起系统误差，随机误差和系统误差在一定条件下能相互转化。
（二）实验误差的表示方法
因误差性质不同，实验误差采用不同的表示方法，主要有以下几种：
1.平均误差：
平均误差是指一组测定值中，测定值与均值之差的平均值。
2.标准偏差（标准差）：
标准偏差是方差（S2）的平方根值，用S表示。
它是表示精密度的较好的指标。
标准差的单位和原始数据相同，测定次数一般要求在10次以上。
3.绝对误差和绝对偏差：
（1）绝对误差指测定值与真值间的差值，即绝对误差=测定值（X）-真值（T）。
绝对误差有正值和负值。
（2）绝对偏差指测定值与测定均值间的差异，即绝对偏差=测定值（X）-测定均值（
）。
绝对误差、绝对偏差表示误差绝对值的大小，无法比较测定误差之间的大小。
4.相对误差和相对偏差：
相对误差为绝对误差与真值的百分比值，相对偏差为绝对偏差与测定均值的百分比值。
5.变异系数（coefficientofvariation，CV）：
CV是样本标准差与样本均数的百分比值,即。
CV值用于比较各组数据间的变异情况，不受单位影响。
CV值越大,测定值离散度越大，精密度越差。
二、方法评价的基本内容和步骤
（一）方法评价的基本内容
方法评价的基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度和准确度。
在实验中实际测定的是不精密度与不准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。
方法学评价的各项实验是为检测各种类型的实验误差而设计的。
它们间的相互关系见表3-6。
（二）方法评价步骤
根据方法选择的要求确定某方法（候选方法），在使用前最好经本实验室进行评价实验，方法评价步骤如下：
1.评价前实验：
重点研究候选方法的最适条件。
最适条件包括试剂浓度、缓冲体系的种类、离子强度和pH值、反应温度和时间、样品体积分数、检测波长、方法线性范围等。
对文献报道的条件作必要的验证。
2.初步评价：
包括批内和日内重复性试验、回收试验、干扰试验。
3.最后评价：
依顺序作日间重复性试验，方法比较试验和总体判断方法是否可接受。
4.评价后实验：
如方法可接受，则进行临床相关研究，包括参考值确定和特殊病人标本的测定等。
5.方法应用：
建立质控系统，培训操作者，引入常规工作等。
方法评价是一项科学性强、方法严谨、费时耗力的工作，应将实验方法和结果进行科学的整理和总结。
三、方法评价指标
实验方法评价指标包括精密度、准确度、检测能力等。
（一）精密度
精密度（precision）是表示测定结果中随机误差大小程度的指标。
1.概念：
表示同一标本在一定条件下多次重复测定所得到的一系列单次测定值的符合程度。
2.
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