蛋白质含量检查方法验证方案.docx
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蛋白质含量检查方法验证方案
方案批准
蛋白质含量检查方法验证方案
吉林亚泰生物药业股份有限公司
2015年10月
题目
蛋白质含量检查方法验证方案
起草人部门职务起草日期
审核人部门职务审核日期
批准人部门职务批准日期
1.目的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4
2.范围和责任
3.人员确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4
4.引用标准⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4
5.材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
5.1仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
5.2器材、用具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
6.风险因素分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
7．内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
7.1检查法验证简述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
7.2验证方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
7.3验证步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5
8.偏差⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7
9.附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8
1.目的
在进行常规的蛋白质含量检查之前，需验证在实际检验条件下，检验用物
品及操作程序不得对检验方法造成不良影响。
本试验是关于对本公司产品
的蛋白质含量检查方法的验证，结果应显示：
本公司产品的蛋白质含量的检查方法符合验证要求。
2.范围和责任
2.1.本验证方案适用于吉林亚泰生物药业股份有限公司人用狂犬病疫苗（地鼠
肾细胞）纯化原液、精制卡介菌多糖核酸检验方法的验证。
2.2.验证委员会：
负责验证方案的审批；验证的协调工作，以保证本验证方案
规定项目的顺利实施；验证数据及结果的审核；负责验证报告的审批。
2.3.质量控制部：
负责本验证方案、报告的起草与实施，并做好相应的记录；
在验证过程中对验证相关SOP进行确认。
2.4.验证管理部：
负责验证过程中的组织协调，负责审核验证方案和验证报告，
并对验证全过程进行跟踪和督导
2.5.质量保证部QA：
参与验证实施，协助验证部门对过程中出现的偏差进行
处理。
2.6.质量副总：
批准验证文件。
3.人员确定
确定参与本次验证的人员并要求所有参与人员签名确认
小组职务
姓名
所在部门
签字
日期
组长
孙丽萍
质量控制部
组员
张晶
质量控制部
组员
赵磊
验证管理部
组员
范博
质量保证部
4.引用标准
4.1.《蛋白质含量测定SOP》
4.2.《偏差管理SOP》
4.3.《中华人民共和国药典》2015版第四部
5.材料
5.1仪器设备
5.1.1紫外分光光度计、电子天平
5.2器材用具
5.2.1.比色皿、量瓶、刻度吸管、具塞试管
6.风险因素分析
评估
项目
潜在风险
风险
级别
控制措施
是否需
要确认
专属性
不能正确检出被测物。
中
进行专属性试验证明辅料等基质成分对待检成分检出无影响。
低
重现性
不能准确测定出被测物含量。
中
进行重复性试验证明该方法的精密度可以满足试验要求。
低
线性与范围
不能准确测定出被测物含量。
中
进行线性试验证明该物质的浓度与含量成正比例关系。
低
7.内容
7.1检查法验证简述
蛋白质含量测定系采用福林酚法（Lowry法），蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。
在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
7.2验证方法严格按照蛋白质含量检验方法，准备人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液样品、精制卡介菌多糖核酸样品各3批和试验材料，并依据检验方法的操作步骤对样品进行多次检验，验证试验结果均应表明试验的专属性、重现性及线性与范围均能达到试验要求。
7.3验证步骤
7.3.1.文件检查
7.3.1.1.目的：
验证所需的参考文件是完整可用的。
7.3.1.2.测试方法：
根据资料清单，逐一检查文件的完整性。
7.3.1.3.可接受标准：
所有必需的文件必须是可用的和经过批准的。
7.3.1.4.记录：
见附录1。
7.3.2.培训
7.3.2.1.目的：
确认参与验证的人员都经过此方案和相关SOP的培训。
7.3.2.2.测试方法：
检查培训记录。
7.3.2.3.可接受标准：
验证执行前，参与验证的人员已进行此方案和相关SOP的培训。
7.3.2.4.记录：
见附录2。
7.3.3.测试用仪器、仪表检查
7.3.3.1.目的：
对测试用仪器、仪表进行确认。
7.3.3.2.测试方法：
检查仪表参数和设备登记卡。
7.3.3.3.可接受标准：
测试用仪器、仪表符合测试要求。
7.3.3.4.记录：
见附录3。
7.3.4.试剂配制
7.3.4.1.碱性铜试液：
取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合作为乙液。
临用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。
7.3.4.2.标准品溶液的制备
取血清白蛋白（牛）标准品1支，至50ml量瓶中，加水稀释至刻度，用刻度吸管移取10ml至25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
7.3.4.3.供试品溶液的制备
精密量取供试品溶液1ml至具塞试管中。
7.3.5.线性关系考察
7.3.5.1.精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→16]4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
7.3.5.2.可接受标准蛋白质浓度和其吸光度在在规定范围内呈线性，相关系数（R2）≥0.995。
7.3.5.3.记录：
见附录4.
7.3.6.专属性
7.3.6.1.精密量取空白辅料溶液、供试品溶液与标准蛋白质溶液各1ml置玻璃试管中，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→16]4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
7.3.6.2.可接受标准
空白辅料溶液对蛋白质含量测定无干扰；供试品溶液与标准蛋白质溶液在650nm波长处有吸收峰；
7.3.6.3.记录：
见附录5。
7.3.7.重现性
7.3.7.1.取供试品人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液3批，取精制卡介菌多糖核酸3批，精确称取0.1g样品用10ml水稀释，分别精确量取1.0ml样品，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→16]4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
7.3.7.2.可接受标准每批供试品的平行含量测定结果的相对标准偏差应不得过2.0%。
7.3.7.3.记录：
见附录6。
8.偏差当该方案的某一部分无法实施或实际情况无法达到可接受标准时，需要进行偏差报告。
当偏差出现时，参考《偏差管理SOP》处理，确保所有的偏差得到评估和有效的解决。
验证过程中产生的偏差记录在附录7。
9.
附录
9.1.
附录1：
文件检查确认记录
9.2.
附录2：
培训记录
9.3.
附录3：
仪器、仪表校验检查记录
9.4.
附录4：
线性关系检查记录
9.5.
附录5：
专属性检查
9.6.
附录6：
人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液含量测定记录
9.7.
附录7：
精制卡介菌多糖核酸含量测定记录
9.8.
附录8：
验证偏差
附录1文件检查确认记录
资料名称
文件编号
存放地点
是否可接受
蛋白质含量测定SOP
JYT-SOP03-5-1-033
质量保证部
是□否□
偏差管理SOP
JYT-SOP02-7-0-003
质量保证部
是□否□
测试的符合性□合格□不合格
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
附录2培训记录
培训课题
蛋白质含量检查方法验证方案的培训
培训目的
使被培训人员掌握蛋白质含量检查方法的验证方法和过程
培训内容
蛋白质含量检查方法的验证方法
培训日期：
培训时间：
—共小时
培训师：
培训方式：
培训地点：
培训人员签到：
姓名
签字
姓名
签字
姓名
签字
赵磊
张晶
范博
测试的符合性□合格□不合格
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
附录3仪器、仪表校验检查记录
仪器、仪表名称
型号
设备编号
生产厂家
是否接受？
（Y/N）
紫外分光光度计
UV-2401PC
03A-032
日本岛津
是□否□
电子天平
FA224
03B-164
上海舜宇恒平科学仪器有限公司
是□否□
测试的符合性
□合格□不合格
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
附录4线性关系检查记录
浓度（μg/ml）
40
80
120
160
200
A值
曲线方程
相关系数r2
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
附录5专属性检查记录
样品名称
在650nm处A值
空白辅料溶液
人用狂犬病疫苗（地
鼠肾细胞）纯化原液
精制卡介菌多糖核酸
标准品溶液
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
附录6人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液含量测定记录
检品名称：
人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液
检品来源：
检品批号：
检验日期：
年月日
报告日期：
年月日
检验依据：
《蛋白质含量测定SOP》JYT-SOP03-5-1-033
1.仪器设备
紫外-可见分光光度计：
型号编号
校验有效期至
2.检验方法：
lowry法
2.1.标准蛋白质溶液的制备：
取蛋白质标准品1支，用胶头滴管加注射用水定容至ml容量瓶中，摇匀，即得标准蛋白质溶液贮备液。
取标准蛋白质溶液贮备液ml定容至ml容量瓶中，即为μg/ml
标准蛋白质溶液。
2.2.供试品溶液的制备：
取供试品，加水制成含蛋白质约200μg/ml的溶液，摇匀，即得供试品溶液。
再用刻度吸管精密量取供试品溶液1ml。
2.3.标准曲线的制备：
用刻度吸管精确量取标准蛋白质溶液（μg/ml）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml
分别置于试管中，用刻度吸管加水补至1ml。
再用刻度吸管准确量取水1ml，作空白对照。
2.4.测定：
取上述溶液，用刻度吸管加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→16]4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
标准曲线：
标准蛋白质溶液（μg/ml）650nmA值
直线方程：
r=；Y＝a+bx＝
结果计算：
用直线回归法计算结果。
蛋白质含量（μg/ml）=样品相当于标准溶液体积数×稀释倍数测定结果：
稀释倍数____
检品批号
吸收值
含量
（μg/ml）
平均值（μg/ml）
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
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附录7精制卡介菌多糖核酸含量测定记录
检品名称：
精制卡介菌多糖核酸
检品来源：
检品批号：
检验日期：
年月日
报告日期：
年月日
检验依据：
《蛋白质含量测定SOP》JYT-SOP03-5-1-033
1.仪器设备
电子天平：
型号编号校验有效期至
紫外-可见分光光度计：
型号编号校验有效期至
2.检验方法：
lowry法
2.1.标准蛋白质溶液的制备：
取蛋白质标准品1支，用胶头滴管加注射用水定容至ml容量瓶中，摇匀，即得标
准蛋白质溶液贮备液。
取标准蛋白质溶液贮备液ml定容至ml容量瓶中，即为μg/ml
标准蛋白质溶液。
2.2.供试品溶液的制备：
用精度为0.0001g的电子天平精密称取本品约0.1000g置10ml量瓶中，用胶头滴管加适量水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
再用刻度吸管精密量取供试品溶液1ml。
2.3.标准曲线的制备：
用刻度吸管精确量取标准蛋白质溶液（μg/ml）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml
分别置于试管中，用刻度吸管加水补至1ml。
再用刻度吸管准确量取水1ml，作空白对照。
2.4.测定：
取上述溶液，用刻度吸管加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→16]4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
标准曲线：
标准蛋白质溶液（μg/ml）650nmA值
直线方程：
r=；Y＝a+bx＝
结果计算：
用直线回归法计算结果。
以标准蛋白质溶液浓度与对应A值求回归公式，应用该公式计算样品蛋白质含量。
蛋白质含量应“<0.5%”。
蛋白质含量%
=样品相当于标准溶液体积数×稀释倍数×100%
样品重量×106
检品批号吸收值样品质量g含量（μg/ml）平均值（μg/ml）
测试的符合性
□合格□不合格
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
审核人：
日期：
附录8验证偏差
偏差记录名称及编号
偏差是否已解决或已有解决方案
追踪人
结果分析与评价：
评价人：
日期：
备注：
□无（如没有，打勾）
检查人：
日期：
年月日
审核人：
日期：
年月日
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