应用荧光定量实时pcr检测蜜蜂王浆主蛋白3基因的表达.docx
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应用荧光定量实时pcr检测蜜蜂王浆主蛋白3基因的表达
应用RT-PCR、SDS-PAGE和GPC-RI-MALLS研究mrjp3基因表达及蛋白含量
第一章文献综述
蜜蜂作为昆虫纲（Insecta），膜翅目（Hymenoptera），细腰亚目（Apoerita）蜜蜂总科（Apoidae），蜜蜂科（Apidae），蜜蜂属（Apis）中的经济昆虫。
在被人类驯化后，能生产蜂蜜、蜂花粉、蜂蜡、蜂胶和蜂王浆等蜂产品，并为植物传授花粉，提高农作物的产量和质量[1]，在提供天然有机产品，维持生态平衡中发挥着重要作用。
我国为世界养蜂大国，饲养的蜂群数居世界第一（约700万群），约占世界蜂群总数的八分之一。
各地均有蜜蜂饲养，品种除了我国本地的中华蜜蜂（ApisCeranaCerana）以外，目前主要饲养的是生产能力极强的西方蜜蜂-意大利蜜蜂（Apismellifera），即意蜂，同中国的本土蜂种群体相比，有其自身的特点和优势。
意蜂分蜂性弱，能维持强群，善于采集持续时间长的大蜜源，能够规模集约化生产。
造脾快，产蜡多，性温和，不怕光，提脾检查时，蜜蜂安静，便于人工生产王浆。
蜂王产卵力强，工蜂哺育力强，分泌蜂王浆多，在目前阶段，是实现大规模生产王浆的主要蜂种。
1.蜂王浆的基础研究进展
1.1蜂王浆在蜂群中的作用
蜂王浆，又名王浆、蜂皇浆、皇浆、蜂乳。
蜂王浆作为5—15日龄工蜂王浆腺分泌的乳白色生物活性物质，是蜂王及幼虫前期的食物。
其在维持整个蜂群的社会性正常运转，以及对蜜蜂的生产发育及维持蜂王高繁殖性状起着至关重要的作用。
首先蜂王浆决定着蜂群中受精卵的发育，在王台内的受精卵，孵化之后哺育工蜂用分泌的蜂王浆对其进行喂饲，在整个幼虫发育期间都食用蜂王浆，其生殖系统及相应的器官获得充分发育，羽化后的成虫就是蜂王。
而那些在工蜂房内的受精卵，孵化后的头3天哺育工蜂用工蜂浆对其喂饲，从第3天后逐渐改用蜂粮（花粉和蜂蜜）进行喂饲，其生殖器官发育受到抑制，羽化后的成虫就成为没有生殖能力的工蜂[3]。
其次，蜂王浆加速了蜂王的个体发育，蜜蜂是一种全变态的社会性昆虫，即在个体发育中要经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。
蜂王和工蜂的卵期都是3天，卵在3天之后孵化为幼虫，在王台之内的蜂干幼虫因为吃的是蜂干浆，其幼虫期只有5天，蛹期8天，到第16天羽化为蜂下。
而那些在T蜂房内的幼虫，因为食料与蜂王幼虫不同，其幼虫虫期延长为6天，蛹期延长为12天，到第21天后方羽化为工蜂成虫，其个体发育为成虫的时间比蜂王多用了5天，其形体也比蜂王约小50%。
再次，蜂王浆能维系蜂王的正常生理机能，使蜂王具有较长的寿命，它的寿命一般为3-4年，最多为8年;而吃蜂粮的工蜂，在生产季节只能存活50天左右，即使是在半冬眠状态的越冬期最多也只能活11个月。
也就是说吃蜂王浆的蜂王，其平均寿命比吃蜂粮的工蜂增长了30倍以上。
蜂王在蜂群中的主要职能是产卵，在繁殖季节它不停地在巢内产卵，最盛时一天可以产下1500-2000粒卵，这些卵的总重量约与蜂王自身的体重相等[4]。
这样一台“产卵机器”全由蜂王浆所提供的营养来驱动和支持。
由此可见蜂王浆本身具有神奇的营养和调节功能。
1.2蜂王浆的理化性质
1.2.1蜂王浆的物理性质
新鲜的蜂王浆多数呈乳白色或淡黄色，个别呈微褐色，为半透明的浆状物质，有光泽，手感细腻，微粘，无气泡，无杂质，具有蜂王浆独特的香气，口感微甜、酸、涩和辛辣。
蜂王浆部分溶于水，呈悬浊液，能溶于强酸和强碱，部分溶解于乙醇，产生白色沉淀，但小于蜂蜜，放置一段时间后分层。
蜂王浆的比重略大于水，比重为1.08，蜂王浆一般pH值为3.5-4.5，性质不稳定，常温下容易变质。
蜂王浆一般含水量为62.5%-70%，干物质占30%-37.5%，干物质中，糖类占20%-39%，脂肪占7.5%-15%，矿物质占0.9%-3%，维生素占1%，此外还有无机盐、有机酸、酶、激素及其他生物活性物质[5]。
1.2.2蜂王浆的化学成分
随着近年来理化分析技术的发展，对蜂王浆的生物理化特性以及对人体生命活动调节作用有了较为深入的认识。
蜂王浆主要由蛋白质、脂类、糖类、碳水化合物、小分子物质（维生素、氨基酸、游离氨基酸等）等组成。
（1）蛋白质
蜂王浆中的蛋白质有大约2/3是清蛋白，1/3是球蛋白，其含量比例与人体血液中的清蛋白、球蛋白比例基本相同。
蜂王浆干物质中的水溶性蛋白质约占15%-20%，水不溶性蛋白质约占15%，透析性蛋白质约占16%-20%[5]。
（2）氨基酸
蜂王浆中的氨基酸种类丰富，有20多种，包括人体必需的8种氨基酸，且多以游离氨基酸形式存在。
12种游离氨基酸的含量约占干物质的0.8%。
蜂王浆中还发现有调节生理功能的牛磺酸[6]，蜂王浆中总牛磺酸含量平均值为20.89mg/100g，游离牛磺酸含量的平均值为14.09mg/100g，占牛磺酸含量的67.45%。
蜂王浆中的牛磺酸的含量超过母乳（含牛磺酸3.3-4.6mg/10OmL）和牛乳（含牛磺酸0.7mg/100mL）。
（3）糖类
蜂王浆中的葡萄糖占总糖含量的45%，果糖占52%，麦芽糖占1%，龙胆二糖占1%，蔗糖占1%。
Ohashi分离到葡萄糖营酶，分子量约为70道尔顿，可能直接作用于保幼激素，而保幼激素是在诱导工蜂行为和咽下腺细胞作用的改变方面起重要作用[7]。
（4）脂类
蜂王浆中的脂肪酸主要有皮脂酸15%，羟基癸烯酸25%，羟基癸烷酸5%，软脂肪酸5%，油酸5%，还有磷脂、糖脂、蜡、苯酚、胆固醇等。
（5）维生素
蜂王浆中的维生素以B族维生素含量最丰富，包括B1、B2、B6、B12、叶酸、乙酞胆碱等。
蜂王浆中含有乙酞胆碱93.8mg/100g。
因为蜂王浆中含有抗坏血酸酶，所以其中的维生素C含量很低。
此外还有烟酸、泛酸、肌醇、生物素等多种。
（6）矿物质
蜂王浆中的矿物质主要有钾、钠、钙、铁等常量元素，以及铜、锌、锰、钴、镍、硅、铬、金、砷等微量元素。
（7）有机酸
蜂王浆中除了含有琥珀酸等多种有机酸外，还含有自然界其他物质中所没有的10-羟基-△’-癸烯酸（10-HDA），它是蜂王浆中的代表物质之一，故又称王浆酸，在蜂王浆中的含量不一，分离出的纯品为白色晶体，在新鲜蜂王浆中多以游离形式存在，性质比较稳定，有极强的杀菌、抑菌作用，并具有较高的抗癌作用。
Townsend等早在60年代就报道10-HDA的抗肿瘤作用，我国学者也研究了它的抗肿瘤和免疫调节反应[8]。
王国燕等也证明了10-HDA能够增强小鼠腹腔巨噬细胞功能，体外能促进淋巴细胞转化、IL-2产生和L3T4阳性细胞数，并促进腹腔巨噬细胞产生TNF、ILI，抗肿瘤作用是通过增强和调节机体的免疫功能实现的[9,10]。
由于10-HDA具有广泛的免疫调节作用，并且体内抗肿瘤有效，这将使10-HDA有可能作为一种新的生物反应修饰剂应用于临床。
蜂王浆的抗菌作用与10-HDA有关。
Kitahara等研究发现王浆中的10-HDA对皮脂腺脂肪合成的抑制作用，10-HDA已被证明具有抑制脂肪合成的作用，在这个研究中，他们检测了王浆中的其他酷类物质对脂肪合成的影响，发现一系列ω-羟基酸比王浆酸能更有效抑制标记乙酸结合到仓鼠耳朵皮脂腺。
而且，当局部用到雄性仓鼠耳朵，10-HDA和H-轻基-烯酸抑制皮脂腺脂肪生成，但是王浆酸却不抑制[11]。
这些发现说明除王浆酸外，王浆中的其他类型的ω-羟基酸对脂肪合成也有抑制作用。
Sver等报道10-HDA可能有选择地约束B淋巴细胞的细胞膜，干涉这些细胞抗体的分泌，以前的研究证明王浆中丙二酸充当几乎所有类型的细胞的唬拍酸氧化酶系统的抑制剂，然而二轻基酸抑制抗体产生的机制还不清楚[12]。
（8）酶类
蜂王浆中的酶类种类丰富，主要有异性胆碱脂酶、抗坏血酸氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶，此外还有脂肪酸、淀粉酶、转氨酶等重要酶类。
（9）激素
蜂王浆中的激素主要有雌激素，促性激素、肾上皮质类固醇、肾上腺素以及类胰岛素等。
因此蜂王浆对于治疗风湿病、神经官能症、更年期综合症、性机能失调、不孕症等有重要作用。
此外，蜂王浆中乙酞胆碱的含量也相当高，每克蜂王浆中多达1毫克；还含有三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、黄素单核苷酸（FMN）、黄素嘌呤二核苷酸（FAD）等核苷酸，以及一些未知的物质。
1.3蜂王浆的功能
1.3.1免疫调节作用
大量研究表明，王浆蛋白具有免疫调节作用。
Lidiaja等用蜂王浆饲喂用羊红血细胞免疫过的大鼠，发现用蜂王浆饲喂过的大鼠的免疫球蛋白的含量与对照组相比明显降低。
蜂王浆饲喂用羊红血细胞免疫过的小白鼠，发现用蜂王浆饲喂过的小白鼠的脾细胞数明显比对照组多。
试验结果表明，蜂王浆通过刺激个体产生抗体有免疫作用[13]。
Claudia等研究蜂王浆的活性组分的免疫机制，将蜂王浆的活性组分饲喂长有艾氏腹水肿瘤的小白鼠，实验结果证明蜂王浆的活性组分能够有效抑制因肿瘤细胞的增长而导致的骨髓抑制和消除脾脏的造血功能，蜂王浆的刺激能作用于多种骨髓干细胞，这很好地说明了蜂王浆能有效抑制肿瘤细胞生长[14]。
1.3.2抗氧化作用
Takeshi等研究了一些商品蜂蜜、蜂王浆、蜂胶的抗氧化活力，采用脂质过氧化模型评价蜂蜜、蜂王浆、蜂胶的抗氧化能力，发现抗氧化作用随时间的延长活力逐渐下降[15]。
TakeshiandReiji从新鲜的中国王浆中制备水提成分和碱提成分，产量分别是干物质的8.3%和6.3%，通过SDS-PAGE分析，两种提取成分的蛋白条带十分相似，但不完全相同。
两种提取成分的抗氧化活力随浓度的增高而增强，两种提取物对超氧自由基的清除能力很高，浓度为100mg/mL的活力与5mM维生素C的活力相同，虽然水提成分和碱提成分在浓度50mg/mL、100mg/mL时的活力不如1mM维生素E的活力，但能清除样品中约50%-60%的羟基自由基。
这表明蜂王浆中的蛋白成分有强的抗氧化能力和清除自由基的能力[16]。
1.3.3促生长功能
L.A.Salazar-OlivoandV.Paz-Gonzalez研究蜂王浆在生物体内的不同生物学活性，将未加工的蜂王浆刺激Tn-5BI-4昆虫细胞，每毫克蛋白能多生长6.5倍的细胞，而通常用的牛血清只能多生长2.55倍的细胞。
这些未经加工的蜂王浆与用硫化胺从王浆中提取的RJP30和RJP60的效果一样。
RJP30能够刺激鼠科动物的3T3-F442A细胞增殖生长脂肪细胞，与用胰岛素处理的效果相比，多增殖2倍，未经加工的蜂王浆和RJP60同样也有这种效果。
RJP30能对人的子一宫癌细胞产生毒素，用RJP30处理7天后，子宫癌细胞减少2.5倍。
这些实验结果表明蜂王浆能对不同的细胞产生不同的生物学功能[17]。
1.3.4其他
Toshiro等报道完全蜂王浆和它的分离蛋白根本不会阻碍血管紧张肽I-转化酶（ACE）的活力，然而，蜂王浆经胃蛋白酶水解后的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解产物具有抑制血管紧张肤的能力，采用凝胶渗透层析对王浆水解产物进行分离，获得二肽、三肽片断，其中有8个肽是首次从自然资源中鉴定出来的。
因此，王浆蛋白被认为是一种可通过胃肠酶水解获取AcE抑制肤的好资源[18]。
Keity等利用双向电泳和MALDI-PSD/MS测定了整个王浆蛋白质组，补充了61个不同的蛋白质，其中34个蛋白质已经确定，其中27个蛋白属于MRJPs家族，5个蛋白与碳水化合物的新陈代谢和氧化物的降解代谢有关，1个蛋白与铁离子在蜜蜂体内的堆积有关，1个蛋白可能是与调节MRJP1有关。
那些与碳水化合物和能量代谢直接有关的蛋白是α葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和α淀粉酶，这些可能是同一酶类家族，促进葡萄糖水解，乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶可能与能量代谢有关。
这些实验结果支持这个假说：
这些大多数的蛋白可能在饲喂蜜蜂的下颚腺产生并分泌到王浆中[19]。
Juraj等研究蜜蜂清蛋白（Apal）有不同的生物学功能，用蜜蜂清蛋白刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α，蜜蜂清蛋白的重组片断在大肠杆菌BL21中有不同程度的表达，用50mM的精氨酸促进蛋白质的溶解，发现这些重组片断的免疫作用比整个蜜蜂清蛋白的免疫作用还要明显，已经证明了蜜蜂清蛋白的N端重组片断能最有效的使巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α，比其余的3个重组片断的效果还明显[20]。
1.4蜂王浆新鲜度指标的研究进展
早在20世纪80年代，科学家就开始对一些在蜂王浆储存过程中能够量化的指标进行了研究[21]。
但迄今为止，仍然没有一个公认的，可如实反映蜂王浆新鲜度，并能在实际应用中广泛推广的指标。
寻找并确立蜂王浆新鲜度的合适指标并不是一件易事。
蜂王浆国家质量标准（GB/T9697-2002）中规定的一些理化指标反映了蜂王浆中某类物质的含量，能在一定程度上对蜂王浆的质量进行控制，而并不能很好地反映蜂王浆新鲜度及其品质[22]。
蜂王浆新鲜度的研究是一项系统工程。
作为蜂王浆新鲜度的指标，必须符合以下三个条件[23]：
该指标的含量或活性受储藏条件的影响显著；该指标在新鲜蜂王浆中的含量有较高的稳定性；检测方法应尽量简单易行。
也就是说，要得出能如实反映蜂王浆新鲜度且能够广泛推广开来的新鲜度指标，必须要从三方面进行考虑。
其中，第一条是作为蜂王浆新鲜度标准的首要条件。
用什么作为蜂王浆新鲜度的指标，引起了研究者和生产者的极大兴趣，特别是目前几乎所有的新鲜蜂王浆从养蜂生产者到产品加工厂进行加工与分装之间所需的时间，至少要有10d左右，而且在这期间蜂王浆大部分是在野外常温下保存，其新鲜度保持是值得引起注意的。
寻求一个可靠的新鲜度监测指标，成为蜜蜂行业内急需解决的问题。
以下介绍的是国际上研究较多的指标的研究进展。
1.4.1王浆酸
王浆酸（10-DHA）是蜂王浆中特有的不饱和脂肪酸，其含量在2％左右[24]。
10-DHA是1921年德国科学家首次在工蜂上颚腺中发现的[25]，由于其是蜂王浆中特有的不饱和脂肪酸，故又叫王浆酸。
10-DHA是人们评价蜂王浆质量的重要指标[26]。
我国国家标准规定蜂王浆优等品中10-HDA含量为≥1.6%，合格品中10-HDA含量≥1.4%。
蜂王浆的质量标准对于蜂王浆的生产、加工、工艺选用及质量控制有着重要的指导意义。
一个客观的质量标准应能正确的体现蜂王浆的内在质量并能如实地反映蜂王浆的保健功能。
目前各国都以10-羟基-2-癸烯酸含量作为蜂王浆主要质量指标的依据。
由于王浆酸是蜂王浆多种保健功能的重要成分[27]，因此其是蜂王浆的标志物[28]。
一直以来，都是通过王浆酸的含量来断定蜂王浆的品质，但是，并不代表王浆酸含量高的王浆质量就好，更不能说明其新鲜程度[21]。
Antinelli等对来自两个不同国家的蜂王浆样品中的王浆酸含量在不同储藏条件下的变化进行了研究，表明王浆酸在-18℃和4℃条件下储藏12个月，其含量分别减少0.1%和0.2%，在室温条件下，两个产地的蜂王浆中王浆酸的降解率也仅为0.4%和0.6%。
由此得出结论，蜂王浆中王浆酸非常稳定，即使在高温下也只有少量降解[29]。
因此，王浆酸不适合作为蜂王浆新鲜度的指标。
中国蜜蜂研究所张复兴等，日本崎玉养蜂株式会社技术部[30]的实验也得出了相同的结论。
大部分学者都认为，用10-DHA作为蜂王浆的活性指标其科学依据不足，这种标准存在疑点与不足：
王浆酸具有较好的化学稳定性和热稳定性，不是容易分解的物质。
即使蜂王浆中活性蛋白质类物质变质腐败，其王浆酸含量也不会受到影响。
仅以王浆酸作为蜂王浆质量唯一指标的合理性已经引起了人们的争论。
1.4.2王浆肌动蛋白
Kamakura等在2001年发现了一个分子量为57-kDa的单体糖蛋白，命名为RJP-1，发现其降解速率与储存温度及时间成一定的比例关系[31]，故认为蜂王浆中的RJP-1适合作为王浆新鲜度的标记。
镰仓等[32]研究了储藏温度与时间对蜂王浆成分的影响。
发现王浆蛋白质-1（RJP-1）在4℃-50℃和1-7d的储存条件下，逐渐降解。
RJP-1的降解与储存温度和时间呈正比。
后研究将其定性为一种单体糖蛋白，分子量57kDa。
之后，又研究了蜂王浆对雄性小鼠的抗疲劳作用。
得出结论：
蜂王浆能在运动后改善身体的疲劳，这种抗疲劳作用与蜂王浆的新鲜程度有关，可能是与57-kDa蛋白质含量有关。
研究还发现57-kDa蛋白质能够刺激肝细胞DNA合成，延长肝细胞的激增以及增加白蛋白的生产。
因此，认为57-kDa蛋白质可能适合做蜂王浆质量的标记物，与前人的研究相同。
此蛋白是从蜂王浆提取的，能够激活肝细胞，故这种蛋白质称为蜂王浆肌动蛋白[33]。
1.4.3超氧化物歧化酶活力（SOD）
自1938年人们就对SOD进行了一系列的研究，但对蜂产品中SOD的研究较晚[34]。
袁耀东等报道蜂王浆含有SOD，测得其含量为0.403ng/g[35]。
张映等测得鲜王浆SOD活力为135U/g[36]。
然而蜂王浆中SOD活力受多种因素的影响，如储存温度、存放时间长短等条件的影响会使蜂王浆中所含的活性物质SOD发生很大的变化，从而影响蜂王浆的营养保健作用。
闵丽娥等测定蜂王浆中SOD活力为889.57U/g[37]；之后他们用硫酸铵盐析和SehadexG-150柱层析法从蜂王浆中分离出了SOD，利用过氧化氢和乙醇-氯仿实验证明了蜂王浆中的SOD属于Cu/Zn-SOD[38]。
唐朝忠等探讨不同温度储存条件下蜂王浆中SOD活力的变化，得出SOD活力与温度变化和储存时间的关系[39]，最后得出结论：
（1）新鲜蜂王浆中SOD的活力为130U/g，与张映等测得的SOD活力（135U/g）差别不大；
（2）在-18℃下储存一个月SOD活力为122U/g，与新鲜王浆相比变化不大，-4℃下储存10dSOD活力为114U/g，比新鲜王浆略有下降，但是变化不明显，而5℃储存10d后蜂王浆中SOD活力消失。
综上所得结论，蜂王浆中SOD酶的活力受储存温度和时间的变化而发生变化。
1.4.4葡萄糖氧化酶（GOD）
葡萄糖氧化酶（GOD）是一种脱氧脱氢酶，能催化葡萄糖转化成葡萄糖酸，葡萄糖氧化酶是人体重要的供氢体，对脂类合成和生物转化起着重要的作用。
但是，GOD不稳定，见光易分解。
日本学者井上秀雄确认蜂王浆中含有GOD[40]。
在随后的研究中，吴粹文得出了新鲜王浆中的GOD活力在3.30-3.80U/g之间，其活力会随时间和温度的变化而变化，认为GOD的活力在一定程度上也能够反映蜂王浆的新鲜度。
郑火青等的观点与此相同[21]。
1.4.5水溶性蛋白
新鲜蜂王浆中含有水溶性蛋白和水不溶性蛋白，其中水溶性蛋白为主要成分，占总蛋白含量的46-89%。
蜂王浆粗蛋白质中有许多特别的肽和蛋白质类[41,42]，这些肽和蛋白质类是重要的营养和保健因子，具有多项保健因子。
国内外学者对蜂王浆中水溶性蛋白质和其中的肽与蛋白质都进行了深入的研究。
浙江大学学者通过福林酚试剂法和SDS-PAGE2种方法对水溶性蛋白质的组成和性入地进行了研究[43]，得出蜂王浆水溶性蛋白由P1（18.4ku）、P2（23.1ku）、P3（25.0ku）、P4（34.5ku）、P5（41.1ku）和P6（45.0ku）6种常量蛋白和其他微量蛋白组成，这些水溶性蛋白在4-35℃和不同时间储存条件下都会降解，其中P6（45.0ku）的降解最为明显；相同储存时间内，蜂王浆水溶性蛋白含量随储存温度的升高而降低；相同温度条件下，随储存时间的增加其含量会逐渐降低。
朱丹实试验得出了在环境湿度、敞口包装条件下，不同储藏时间对蜂王浆的影响。
在室温环境下，水溶性蛋白质含量会明显升高[24]，认为原因是一些水不溶性蛋白质发生氧化变质生成水溶性蛋白质。
在0-4℃储藏时，蜂王浆的水溶性蛋白质含量略有升高，是因为低温对水溶性蛋白质有很好的保护作用。
陈崇羔等研究了水溶性蛋白质在新鲜蜂王浆中含量的稳定性。
得出结论，不同产地，花期，批次的蜂王浆中水溶性蛋白质的组分不同[44]，充分说明，各种差异，都会对蜂王浆中水溶性蛋白组分造成不同。
2.王浆主要蛋白的研究进展
蜂王浆是蜜蜂咽下腺和下颗腺分泌的浆状物质，是饲喂蜂王的主要物质，同时也是蜜蜂级型分化的决定物质之一。
近年来，随着分子生物学技术和各种分析仪器的发展，王浆蛋白的生物学功能研究也越来越成为研究的热点。
蜂王浆的化学组成因季节和区域的不同而有所不同，其含水量60%-70%，蛋白质12%-15%，碳水化合物10%-16%，脂类3%-6%，小分子物质2%-3%，蛋白质占新鲜王浆的12%[19]，约占王浆干物质重的50%[45]。
王浆蛋白包括水溶性蛋白和水不溶性蛋白，水溶性蛋白占总蛋白含量的46%-89%，为王浆蛋白的主要部分，称为MRJPs（MajorRoyalJellyProteins）；另外，Sehmitzova等1998年曾根据研究结果推测王浆中MRJPs的含量可能达到90%，蜂王浆所具有的医疗保健作用和生物学功能，可能与王浆中的MRJPs有密切关系[46]。
水溶性蛋白的研究方法主要是用层析法和电泳分析，主要研究内容为水溶性蛋白的成分、免疫学特性以及进化，而对于王浆蛋白的个体成分特征的研究较少，一些酶的活性已经测定出来，第一个被测定的王浆蛋白是抗菌肤Royalizin[47]，随后进行了一系列的克隆和序列测定及表达表达研究[48]。
2.1MRJPs的序列研究进展
王浆主蛋白属于一个蛋白家族，分子量在49-87kDa，纯化蛋白的N端和cDNA序列有高度的同源性，它占总蛋白的82%，除了黑腹果蝇的黄蛋白外，他们和其他昆虫没有任何亲缘关系[49]。
一般认为它们是蜜蜂幼虫生长所必需氨基酸和氮素的主要来源，Schmitzova等报道MRJPs含有很高的蜜蜂生长发育所必需的十种氨基酸，MRJPl（48%）、MRJP2（47%）、MRJP3、MRJP4有一个相对低的必需氨基酸的含量，MRJP3（39.3%）、MRJP4（44.5%），但是个别的氨基酸含量却很高，MRJP3Aig（4.9%），Lys（5.8%）、MRJP4Leu（9.7%），Val（8%），我们对得到的中华蜜蜂假定氨基酸序列作氨基酸组成分析的结果和意大利蜜蜂一致，MRJPs中蜜蜂生长发育所必需的十种氨基酸的含量分别是MRJP1（40.6%）、MRJP2（45.3%）、MRJP3（37%）[46]。
Drapeau等在蜜蜂基因组测序完成的基础上，利用BLAST和PSI-BLAST方法搜索西方蜜蜂基因组中与已知的MRJPS基因同源的序列，最终发现了两组基因。
一组包含了9个基因，他们所编码蛋白的同源性在60%左右，将这九个基因命名为mrjp1-9，绝大部分改组的基因已有相关报道[46,50-53]。
有趣的是这一组基因中还包含一个编码不完全多肤的基因，称其为mrjp-ψ。
至今还未检测到mrjp-ψ的转录本，推测这一假基因可能是种群中被分离的一个无效的基因。
第二组由十个进化关系相对较远的相关基因组成，它们与所知的MRJPs有很明显的相似性，编码蜜蜂中与果蝇Yellow相关蛋白同源的蛋白，西方蜜蜂基因组中这十个基因分别命名为少yellow、yellow-b、yellow-e、yellow-e3、yellow-f、yellow-g、yellow-g2、yellow-h、yellow-x1和yellow-x2。
研究发现九个MRJPs的内含子和外显子的结构非常保守，每个基因的编码区均含有五个内含子，且每个内含子在基因上的位置非常一致。
不同MRJPs之间内含子的大小在一定范围内有差异，但是，因为它们之间的高度相似性以及完全相同的转录相，DrapeauMD等人推断这一组基因在不久前由一个共同的祖先进化而来[54]。
Drapeau等[51]指出，从yellow样基因在MRJPs基因簇两侧的排布情况，及yellow样基因内含子与外显子结构上同MRJPs基因的相关性方面来看，一系列MRJPs的形成起源于yellow-e3基因的复制扩增。
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