实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证Word文档格式.docx
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养，以促进细胞的愈合恢复。
4•阳性转化的培养基筛选方法。
普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌
落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳性，故需要进行PCF鉴定。
5.菌落PCR的原理
通过目的基因的引物进行菌落PCR如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过PCF获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。
从而将阳性与伪阳性菌落区分开。
3.实验材料及设备
1.实验材料：
（1）已完成酶切的载体与目的基因片段。
DNA连接酶，缓冲液等。
（2）冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。
2.实验仪器：
（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000卩L取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；
（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。
（3）PCR仪
3.实验试剂：
（1）质粒的转化与转化导入
a.DNA连接酶d.酶切后的pET28a、目的基因
片段等。
b.lOXbuffer;
c.卡那霉素；
e丄B培养液:
胰蛋白胨（Tryptone）10g,酵母提取物（Yeastextract）
5g，NaCI5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5;
（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测
a.Goldview（DNA染料）
b.1xTAE缓冲液
c.上样缓冲液（6xbuffer）
（3）PCR
a.loadingbuffer
b.四种脱氧核糖核苷酸原料、Taq酶、上下游引物
c.ddH2O
4.实验方法及步骤
实验流程图
离心收豪就陣
TSmtco-a-CaClj
1.质粒的连接转化
a）在EP管中分别配置下列的体系:
0.2mlEP管
10Xbuffer
2.5yL
酶切后的pET-28a
7.5yL
酶切后的目的基因片段
13yL
T4DNA连接酶（考虑连接效率）
2yL
X:
丫=1:
10〜30,总体积25卩L
b）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱
20C下保存备用。
2.
22C反应30min,-
转化质粒的导入
a）取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每100卩L解冻的感
受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min。
b）42C热冲击45秒，立即置于冰浴5min。
c）热激法：
使用化学试剂（如CaCI2）制备的感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA想粘附并在细胞表面形成脱氧
核糖酸酶的羟基-磷酸钙复合物。
此时，将该体系转移到420C下
做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈运动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收；
d）冰浴过程中不要摇动EP管；
（使破裂的菌体自然恢复）
e）再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37C摇床
中培养1h。
目的：
使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性
基因；
f）涂布于含有kana的LB固定培养基表面，37C培养过夜
3.
PCR鉴定假阳性
1.在0.2mLEP管内配制25卩LPCR反应体系1个:
的样品一定将样品加于管壁上或者液体中，防止漏样;
加样的顺序：
先加ddH2Q其次是缓冲液和菌落，最后加酶，且要把样品加到液面下，酶从-200C冰箱中拿出后放在冰中待用，加酶时枪尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓慢吹吸几次，保证足够的酶量；
2、用灭菌枪头挑单菌落（在培养皿背面做好标记）接触EP管内，
混匀瞬时离心，每组可做5个体系。
由于反应体系体积太小，引起的误差较大，可以一次配置多个（比
所需反应体系个数多一个）反应体系，然后分开；
3、放入PCR仪中，设置反应程序:
194C预变性5min;
294C变性30S;
使双链的DNA模板解旋为单链；
355C退火30S;
引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
472C延伸60S;
Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5'
一3’方向，复制模板的互补链；
5重复步骤②〜④30次；
（1）新合成的DNA分子可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。
（2）一般进行30个循环，因为此时目的分子的扩增进入平台期；
672C延伸10min;
最后4C保藏。
4.跑胶验证：
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1XTAE缓冲液淹没过胶板5mm用取液器将PCR产物5卩L与1卩L上样缓冲液（6X）混匀，加入胶板的样品小槽内。
将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的
蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1〜2cm处，停止电泳。
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为
254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
5.实验结果
菌落生长情况:
可以看到，左侧的工程菌形成较多菌落，而右侧几乎没有生长，两组工程菌的差异主要在于热激时长（受错误实验操作步骤影响，右侧实验组2只热激了20s，而左侧为正常的45s）
菌落较小，且分布密集，说明菌液浓度过高或者没有摇匀。
图i平板工程菌生长情况（左实验组
1右实验组2）
PCR实验结果
Marker:
DL2000
A带：
2000bp
B带1000bp
C带750bp
D带500bp
F带250bp
G带100bp
图2菌落PCR凝胶电泳紫外荧光检测结果
说明：
泳道编号依次为：
1红色荧光蛋白工程菌2绿色荧光蛋白工程菌
3绿色荧光蛋白工程菌（老师提供），4DL2000Maker
所得条带较为清晰，部分呈现“U型”可能是电压过高，胶板温度过高。
泳道123都产生了长度约800bp的条带，与预期结果较为接近，且GFP组的分子量大于RFP组，与事实一致。
证明所验证的三个菌落均为阳性菌落。
老师所提供GFP工程菌由于菌体较多，可见大肠杆菌基因组条带（3条带1000bp到2000bp之间）
泳道1的下方还出现了一条约300bp的清晰条带，可能是引物因为巧合而PCR扩增出的杂带。
6.结果讨论与结论:
1.实验结论：
通过DNA连接酶，我们将目的基因片段与载体质粒混合，再通过热激发，我们成功将转化质粒导入DH5a,并用含有Kana霉素的固体
LB培养基验证，证明所检测的三个菌落都不是假阳性。
2.讨论一：
PCR一般循环重复25〜30次，重复次数过多会怎
丿羊？
答：
溶重复次数过多，虽然在一定程度上能够提高产物量，
但是由于反应时间过长，有一些非特异产物的扩增和碱基错配数
也会相应增加；
而且随着酶的扩增能力下降，合成目标片段的能
力也会随之下降，也可能引起其他的非特异性扩增；
此外还可能会导致PCR反应“平台效应”的出现
3.讨论二：
挑取单菌落的注意事项有哪些？
（1）培养皿底部朝上，在酒精灯火焰20cm内操作;
（2）操作时不要讲话，在无风处操作；
（3）挑斑器具要求无菌;
（4）挑选远离群菌落的单菌落，菌落不要过大；
4.讨论三：
2.TaqDNA聚合酶的特性和菌落PCR的原理。
TaqDNA聚合酶的特性：
TaqDNApol具有5'
—3'
聚合酶活性和3'
—5'
外切酶活性，但体外使用的Taq酶无3'
外切校正活性。
Taq酶最大的特点是耐热性；
另外还具有高的催化合成特性。
菌落PCR的原理：
直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行
PCR扩增，可以快速鉴定菌落是否为含有目的基因的阳性菌落，此
per的方法通常被用来进行筛选插入的目的基因或者DNA测序分
析。
最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的片断大小。
5.讨论四：
BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征，用处。
（1）DH5a和BL21都可以作为表达宿主。
（2）BL21是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，
做蛋白表达是比较适合用的，。
BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵
BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。
（3）DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿主株。
DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNA
POLYMERAS职别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。
而带有T7启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7启动子的
T7RNAPOLYMERAS在DH5a中没有。
对于BL21，已将T7RNAPOLYMERAS的编码基因整合到了菌的基因组上，能识别T7启动子，从而可容纳外源基因在此T7启
动子的带动下表达。
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