微生物学实验指导.docx

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微生物学实验指导

实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、大小的测定和计数

一、实验目的

1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养

2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片，学会绘制生物图

3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法

4、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法

二、实验器材

1、显微镜

2、微生物标本装片

3、目、物镜测微尺

4、血球计数板

5、酵母菌液或霉菌孢子液

6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等

三、显微镜的构造、原理及使用方法

1、构造

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。

机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器；光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。

显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。

2、操作

在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。

一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。

四、微生物大小的测量原理和方法

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。

用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。

1、目镜测微尺（图1-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。

测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

2、物镜测微尺（图1-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。

校正时，将物镜测微尺放在载物台上，由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即物镜测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

3、目镜测微尺的校正

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。

先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1-3），计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。

因为物镜测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

例如目镜测微尺5小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

4、细胞大小的测定

移去物镜测微尺，换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。

测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。

结果计算：

长μm＝平均格数×校正值

宽μm＝平均格数×校正值

大小表示：

宽μm×长μm

五、微生物细胞数量的测定原理和方法

1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图1-4），计数区的刻度有两种：

一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。

但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

已知：

1mm3体积=10mm×10mm×10mm=1000mm3

所以：

1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。

因此：

每ml菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）

图1-5计数室

2、计数方法

（1）视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。

（2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

（3）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。

也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。

然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

（4）静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

（5）计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。

如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。

如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

（6）对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。

每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。

（7）测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。

洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒保存。

六、实验结果和思考题

1、结果

（1）绘制所观察的一种或两种微生物的形态，并测量其大小。

（2）将菌液浓度的实验结果填入下表中：

计数次数

每个大方格菌数

稀释

倍数

试管斜面中的总菌数

平均值

1

2

3

4

5

第一次

第二次

2、思考题

（1）在显微镜的使用过程中须注意哪些问题？

（2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？

应如何尽量减少误差、力求准确？

实验二培养基的配置与灭菌

一、实验目的

1、明确培养基配置的原理

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤

3、掌握灭菌锅的使用方法

二、实验器材

1、药品：

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、HCl、NaOH、琼脂、蒸馏水

2、高压灭菌锅、电炉

3、量筒、铝锅、三角瓶、天平等

三、基本原理

对照培养基配制的基本原则：

目的明确、比例协调、pH适宜、经济节约。

本次需要配制的培养基是为下次从土壤中分离细菌用的，所以选择配制适合细菌生长的牛肉膏蛋白胨培养基。

这是一种应用最广泛最普遍的细菌基本培养基，牛肉膏提供碳原和能源，蛋白胨主要提供氮源，NaCl提供无机盐，用HCl和NaOH调节pH，还要加入一定量的琼脂最为凝固剂。

琼脂在大于96ºC时融化，小于40ºC时凝固，通常不被微生物利用。

牛肉膏蛋白胨培养基的配方是：

牛肉膏5g

蛋白胨10g

NaCl5g

琼脂25g

水1000ml

pH7.2~7.4

四、实验容和步骤

（一）配制牛肉膏蛋白胨培养基

1、计算：

根据下次实验的要求和本组人数，每小组需要牛肉膏蛋白胨培养基的量为分离所用9平皿、划线所用每人一平皿、每人一支试管斜面所需培养基的总和，大概350ml。

按照配方，计算出每种药品的需要量。

2、配制溶液：

取一定容量的烧杯或搪瓷杯盛入适量蒸馏水，按培养基配方逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。

牛肉膏、蛋白胨可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足所需容量。

注意：

加热时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。

3、调节pH：

用精密pH试纸测量培养基原始pH值。

若偏酸，逐滴加入1mol/L的NaOH

溶液，边加边搅拌，随时测pH值，直至达约7.6。

若偏碱，同法用1mol/L的HCl溶液调节。

注意不要调过头，避免回滴，否则会影响培养基各离子的浓度。

4、分装：

将配制好的培养基分装入三角瓶和试管中，三角瓶装量不要超过容积的1/2，试管装量不要超过试管高度的1/3，约为5ml。

注意分装速度要快，避免温度过低后琼脂凝固。

5、加塞：

分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入并保证良好的通气性能。

6、包扎：

加塞后，三角瓶外包一层牛皮纸或两层旧报纸，用麻绳以活结形式扎好；试管先用橡皮筋全部捆好，再在棉塞外包牛皮纸或旧报纸，防止灭菌时冷凝水润湿棉塞。

用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

7、灭菌：

将包扎好的培养基放进高压蒸汽灭菌锅，0.103MPa，121ºC，20min，高压蒸汽灭菌。

8、搁置斜面：

将灭菌的试管培养基冷却至50ºC左右，将试管口端搁在玻棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

9、无菌检查：

将灭菌的培养基放入37ºC的培养箱中培养24~48h，检查灭菌是否彻底。

（二）下次实验无菌器材的准备

1、无菌水：

每组在5支普通试管或刻度试管中装入9ml蒸馏水，加塞、包扎、待灭。

2、每组包扎一支1ml移液管、15只培养皿，待灭。

准备好后与培养基一起放入高压灭菌锅灭菌。

五、思考题

1、配制培养基的过程中应该注意些什么问题？

为什么？

2、培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？

如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

附1：

棉塞的制作

棉塞的作用一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。

因此要求棉塞的形状、大小、松紧与容器口尽量适合，过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。

棉塞的长度应2/3在容器，1/3在容器外。

制作过程见图。

图2-1棉塞的制作过程

2：

灭菌锅的操作

（1）加水：

向灭菌器加水，水要淹没加热管。

（2）装锅：

将所要灭菌的物品放入锅中，摆好，不要太挤保证通气，灭菌彻底。

（3）加盖：

盖上灭菌锅盖，拧紧相对螺旋，打开排气阀。

（4）加热：

通上电源加热，至水沸。

（5）排气：

继续加热，排气5~10分钟，使锅的冷空气彻底排出。

（6）加压：

关上排气阀，继续加热使压力上升至0.103MPa，断电。

（7）保压：

通过通、断电使锅压力保持在0.08MPa~0.103MPa，维持20min。

此过程千万不可离人！

（8）降压：

保压时间到后，断开电源，等压力降到0后打开排气阀，放气减压。

（9）开盖：

气排尽后，开盖，冷却。

注意：

高压容器，严格按要求操作，高度注意安全！

实验三纯种微生物的分离、培养及接种技术

一、实验目的

1、掌握梯度稀释平板法分离纯种微生物的原理、方法

2、掌握常规接种技术

3、建立无菌操作意识

二、实验仪器

1、超净工作台、恒温培养箱

2、酒精灯、接种环、酒精棉球等

3、无菌培养皿、无菌移液管、无菌水、灭菌的固体培养基、土样（或活性污泥）等

三、实验原理

土样或活性污泥中含有的微生物数量很多，而且聚集在一起，经过无菌水的梯度稀释可以将微生物充分分散，成单个细胞，涂布到固体平板上，长成单菌落，一个单菌落对应于原土样（或活性污泥）中的一个微生物，乘以相应的稀释倍数可以计算出土样的微生物浓度；将单菌落进一步划线纯化可分离到纯种微生物。

四、实验容和步骤

（一）梯度稀释平板法

1、制备土壤（或活性污泥）稀释液

准确称取土样10g或活性污泥10ml，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。

用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤或活性污泥悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液。

如图（3-1）所示。

2、加菌

将无菌平板编上10-4、10-5、10-6，每一设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。

3、倒平板

上述操作的同时，将培养基加热融化，再冷却到40~50ºC，倾注10~15ml培养基入已含有菌液的培养皿（约2~3mm厚）。

迅速盖上皿盖，平放在工作台上，轻轻转动，是培养基和稀释的菌液充分混合均匀，冷却后，即制成平板。

4、培养

将培养皿倒置，放于30ºC恒温培养箱中培养24~36h，观察结果。

图3-1梯度稀释分离纯种微生物的过程

（二）平板划线

平板划线的主要目的是长出单菌落，得到纯培养。

将融化的培养基无菌操作倒入无菌的空培养皿中。

接种环在火焰上彻底杀菌并冷却后，蘸取少量菌种，在平板表面轻轻地划线（如图），使得初始聚集在一起的细胞渐渐稀释，最后有单个分散的细胞，长出单菌落，达到分离纯化的目的。

将划好线的培养皿倒置于30ºC恒温培养箱中培养24~36h，观察结果。

（三）斜面接种

斜面接种的主要目的是获得纯种微生物的菌体，进行短期保存。

1、在待接种的斜面培养基的试管上部，贴上标签，写上菌名、接种日期等。

2、将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两只试管，中指位于两只试管之间，斜面向上，管口齐平。

3、右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。

右手拿接种环，将接种环可能进入试管的部分在火焰上灼烧灭菌。

4、在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞将它拔出。

试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌烧掉。

将烧过的接种环伸入菌种管，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。

抽出接种环，将试管塞上棉塞，最后再次灼烧接种环，则接种完毕。

五、思考题

1、梯度平板稀释法分离纯种微生物的方法和原理是什么？

2、平板培养皿为什么要倒置培养？

3、观察实验结果，并对结果进行分析。