微生物实验指导.docx

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微生物实验指导

微生物实验指导

生物工程学院编

2004年9月

第一部分基本知识

课程目的与任务

学生实验守则

微生物学实验室常用的器皿

微生物实验室常用显微镜

微生物实验室常用消毒灭菌方法

第二部分基础实验

实验一环境微生物的检测

实验二光学显微镜的使用

实验三细菌的单染

实验四革兰氏染色法

实验五细菌芽孢染色法

实验六培养基的配制和灭菌

实验七微生物的直接镜检记数法

基本接种方法与主要微生物菌落形态的观察

 实验八微生物的培养特征

实验九微生物的分离纯化

实验十大肠杆菌生长曲线测定

实验十一厌氧菌的培养技术

实验十二菌种保藏法

第三部分应用实验

实验十三大分子物质的水解

实验十四抗生素效价的生物测定试验

实验十五IMVIC与硫化氢试验

实验十六微量简易诊检系统

实验十七吞噬作用

实验十八抗原与免疫血清的制备

实验十九牛乳中细菌的检查

实验二十牛乳在自然发酵与酸败过程中细菌的生态学演变酸奶发酵过程的分析检测

第四部分附录

附录I染色液的配制

附录Ⅱ培养基的配制

附录Ⅲ试剂和溶液的配制

附录IVDIGLIB2.0使用手册

课程目的和任务

本课程的目的：

训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。

同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。

本课程的主要任务：

1、掌握显微镜的基本构造，并能正确、熟练操作。

2、通过对细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等微生物的个体形态及菌落特征的观察，掌握对它们进行初步鉴别的知识。

3、掌握常用的几种微生物接种以及菌种保存的基本方法。

4、微生物单染及革兰氏染色方法，以及其在微生物鉴别上的应用

5、掌握培养基的配制与灭菌、纯种分离、以及微生物的镜检计数等基本技能。

6、掌握菌落总数、细菌总数及微生物增殖曲线的测定方法，以及在发酵生产中的应用。

学生实验守则

1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

3．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。

4．实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。

5．实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。

如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。

必要时用灭火机。

6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。

对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。

7．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3％来苏尔液或5％石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。

凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸泡在3％来苏尔液中进行消毒。

8．每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。

实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。

9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅。

10．离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。

微生物学实验室常用的器皿

微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。

一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。

本节将对这几方面作详细介绍。

一、器皿的种类、要求与应用

1．试管（testtube）

微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。

试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图Ⅰ-1，B）而造成污染。

此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图Ⅰ-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。

有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图Ⅰ-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。

试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。

（1）大试管（约18×180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。

（2）中试管（约13—15×100—150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。

（3）小试管（10—12×100mm）一般用于糖发酵试验或血清学试验，和其他需要节省材料的试验

2．德汉氏试管（Durhamtube）

观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6×36mm）（图I-2），此小套管即为德汉氏试管，又称发酵小套管。

3．吸管（又称移液管，pipette）

（1）玻璃吸管（glasspipette）微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管（图I-3，A）。

与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。

市售细菌学用吸管，有的在吸管上端刻有“吹”字。

除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，B），来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。

（2）活塞吸管（pistonpipette）主要用来吸取微量液体，故又称微量吸液器或微量加样器。

其外形和结构如图Ⅰ-4，除塑料外壳外，主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的吸嘴。

按动按钮，通过弹簧使活塞上下活动，从而吸进和放出液体。

其特点是容量固定，使用时不用观察刻度，操作方便、迅速。

国内产品一般每个活塞吸管固定一种容量，分别有5、10、20、25、50、100、200、500、1000μl等不同容量。

而精制的活塞吸管每个在一定的范围内可调节几个容积，例如在5—25μl的范围内，可调节5、10、15、20、25μl五个不同的量，使用时按需要调节，但当调节固定后，每吸一次，容量仍是固定的。

用毕只需调换吸嘴或将吸嘴洗净，消毒后再行使用。

活塞吸管是国外70年代后半期才开始生产与应用的，近年来国内亦日益广泛应用于免疫学和使用同位素等的科学实验中。

4．培养皿（petridish）

常用的培养皿（图Ⅰ-5），皿底直径90mm，高15mm。

培养皿一般均为玻璃皿盖，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养基表面干燥，例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。

在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。

5．三角烧瓶（Erlenmeyerflask）与烧杯（beaker）

三角烧瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶发酵等。

常用的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用来配制培养基与药品。

6．注射器（injector）

一般有1、2、5、10、20、50ml等不同容量的注射器。

注射抗原于动物体内可根据需要使用1、2和5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。

微量注射器有10、20、50、100μl等不同的大小。

一般在免疫学或纸层析等实验中滴加微量样品时应用。

7．载玻片（slide）与盖玻片（coverslip）

普通载玻片大小为75×25mm，用于微生物涂片、染色，作形态观察等。

盖玻片为18×18mm。

凹玻片是在一块厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-6），作悬滴观察活细菌以及微室培养用。

8．双层瓶（doublebottle）

由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-7），内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。

9．滴瓶（dropperbottle）

用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-8）。

10．接种工具

图３－３　接种和分离工具

1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

接种工具有接种环（inoculatingloop）、接种针（inocula-tingneedle）、接种钩（inoculatinghook）、接种铲（inocula-tingshovel）、玻璃涂布器（glassspreader）等（图Ⅰ-9）。

制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。

接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍丝的直径以0．5mm为适当，环的内径约2mm，环面应平整。

接种某些不易和培养基分离的放线菌和真菌，有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要求粗一些，约1mm。

用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻棒弯曲或将玻棒一端烧红后压扁而成。

二、玻璃器皿的清洗方法

清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。

清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。

现分述如下：

1．新玻璃器皿的洗涤方法

新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。

酸溶液一般用2％的盐酸或洗涤液（见本小节“3”）。

浸泡后用自来水冲洗干净。

2．使用过的玻璃器皿的洗涤方法

（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。

热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。

洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架（图Ⅰ-10）上，在室内晾干。

急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。

玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。

装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。

带菌的器皿在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0．25％新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。

带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。

盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。

（2）玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。

量筒或标本瓶底部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损。

待实验完毕，再集中冲洗。

若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。

必要时再用蒸馏水淋洗。

洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。

吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2％煤酚皂溶液或0．25％新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。

吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。

（3）载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5—10分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0．5—2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95％酒精中保存备用。

使用时在火焰上烧去酒精。

用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。

检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在2％煤酚皂溶液或0．25％新洁尔灭溶液中浸泡24小时，然后按上法洗涤与保存。

3．洗涤液的配制与使用

（1）洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：

浓溶液重铬酸钠或重铬酸钾（工业用）50g

自来水150ml

浓硫酸（工业用）800ml

稀溶液重铬酸钠或重铬酸钾（工业用）50g

自来水850ml

浓硫酸（工业用）100ml

配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。

配好后的洗涤液应是棕红色或桔红色。

贮存于有盖容器内。

（2）原理重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸（chro-micacid），酪酸的氧化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。

（3）使用注意事项（a）洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌到时忘记将器皿取出冲洗。

其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即用水洗，再用苏打水或氨液洗。

如果溅在桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去；（b）玻璃器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；（c）此液的使用仅限于玻璃和瓷质器皿，不适用于金属和塑料器皿；（d）有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是因为有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污迹都可清除；（e）盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；（f）洗涤液可反复使用，但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。

三、空玻璃器皿的包装

1．培养皿的包装

培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5—8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。

包好后行于热灭菌。

如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图Ⅰ-11），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。

2．吸管的包装

准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0．5cm处，塞一小段约1．5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。

棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。

然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角（图I-12），并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。

如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。

如果有装吸管的铜筒（图Ⅰ-13），亦可将分别包好的吸管一起

装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用手持粗端拔出。

3．试管和三角烧瓶等的包装

试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验六），然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。

试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。

空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。

如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。

用塑料帽，则宜湿热灭菌。

微生物实验室常用显微镜

一、普通光学显微镜

显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成，具体介绍见实验二

二、暗视野光学显微镜

生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。

暗视野显微镜的原理与来自缝隙的一束强光通过暗室时，可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的，即给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品上反射或折射的光进入物镜，那么，在漆黑的视野中，由于反差增大了，使样品能够看得更清楚。

因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体，故在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。

暗视野显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器，在聚光器的下方中央为圆形黑盘所遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光可进入物镜，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。

如无暗视野显微镜时，只需将明视野显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可；也可在明视野显微镜聚光器下面的滤光镜支架上放一片星形挡板（stardiaphragm）（图Ⅲ-6）构成暗视野，这种方法适用于低倍镜观察。

在暗视野中，由于有些活细胞其外表比死细胞明亮，所以暗视野也被用来区分死、活细胞，此技术现已被用于各种酵母细胞的死、活鉴别。

此外，暗视野显微镜对于观察娇弱的微生物，如梅毒密螺旋体（Treponemapallidum）特别有用。

三、相差显微镜

暗视野显微镜可以看到活细胞的外部形态，但是看不清内部结构。

相差显微镜不仅能观察活细胞的形态，而且还能看到细胞内部结构以及细胞分裂的连续过程。

光线通过透明物体如活细菌细胞后，由于受透明物体中密度和折射率不同的物质的影响，部分光线变成了绕射光，光波的相位发生变化，而这种相位差不表现为明暗和颜色上的差异，不能在显微镜视野中观察到。

相差显微镜就是将经过透明物体的直射光延迟或提前，并和绕射光产生干涉，使相位差变为振幅差。

如果产生的干涉为相长干涉（图Ⅲ-8，R组光线），则振幅的同相量相加而变大，我们便看到较亮的部分；如果所产生的干涉为相消干涉时（如图Ⅲ-8，S组光线），则振幅异相量相消而变小，这部分就变得较暗。

这样，变相位差为振幅差的结果，使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，能更清晰地观察活细胞的细微结构。

相差显微镜成像原理和装置如图Ⅲ-9所示。

在普通光学显微镜上增加下列四种附件就成为相差显微镜：

（1）环状光阑

相差显微镜的聚光镜光阑是环状光阑。

照明光线只能从环状的透明区进入聚光镜再斜射到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光镜）。

大小不同的环状光阑成一转盘（图Ⅲ-10，A），安装于聚光镜下面，更换放大率不同的物镜时，要同时更换与其相应的光阑。

（2）相差物镜（镜头上标有PC或PH字样）

物镜的后焦平面上装有相板，这是相差显微镜的主要装置。

相板上和环状光阑相对应的环状部分大多数是涂的吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。

从标本上射过来的光线，绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，光强度减弱，相位也适当改变。

一般所用的相板推迟相位1/4，吸收80％的直射光，这样，就使直射光和绕射光的强度接近，而相位差则增大或减少。

由于透明标本内部构造的折射率不同，产生绕射光的相位就会有不同程度的推迟，绕射光和直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。

（3）绿色滤光片

为了获得良好的相差，最好用单色光线照明，一般选用绿色光线。

（4）合轴调整望远镜

为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上，必须拔出目镜，装上特别的低倍望远镜（图Ⅲ-10，B），使相板的暗环与环状光阑的明环合轴（图Ⅲ-11）。

微生物实验室常用消毒灭菌方法

消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。

一、加热法

又分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌

有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。

火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。

通常所说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气160—170℃下保温2小时进行灭菌。

2．湿热灭菌

（1）高压蒸汽灭菌法此法是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内1．05kg/cm2　（15磅/英寸2　），121．3℃保持15—30分钟进行灭菌。

时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。

这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。

（2）间歇灭菌法有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。

此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器（图Ⅵ-1）进行灭菌。

该器底层盛水，顶部插有温度计，加热后水蒸汽温度达到100℃时，即循环流于器内，水蒸汽碰到器内物体时，又凝成水，流至底层贮水处，故不至干涸。

灭菌时，将培养基放在器内，每天加热100℃30分钟、连续三天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养基取出放室温下18—24小时，使其中的芽孢发育成为营养体，第二日再加热100℃30分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。

一般凡能用高压蒸汽灭菌的物品均不采用此法灭菌。

（3）煮沸消毒法注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。

一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10—15分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。

二、过滤除菌

许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。

应用最广泛的过滤器有蔡氏（Seitz）过滤器和膜过滤器。

蔡氏过滤器是用银或铝等金属做成的，分为上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。

每次过滤必须用一张新滤板，蔡氏过滤器的结构如图Ⅵ-2。

滤膜过滤器的结构与蔡氏过滤器相似，只是滤膜是一种多孔纤维素（乙酸纤维素或硝酸纤维素），孔径一般为0．45μm，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的滤膜。

三、紫外线灭菌

紫外线波长在200—300nm，具有杀菌作用，其中以265—266nm杀菌力最强。

无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。

四、化学药品灭菌

化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。

实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。

常用的有2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0．25%新洁尔灭、1%升汞、3—5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等。