微生物学实验指导.docx
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微生物学实验指导
微生物实验守则
微生物学实验的目的是：
加深对微生物学理论知识的理解；扎实掌握实验的基本操作，并牢固建立无菌操作的概念；培养学生认真观察、发现问题、分析问题和解决问题的工作能力；树立学生实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、协作攻关的优良作风。
为了提高教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项。
1.每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法，熟悉实验操作中的主要步骤和环节。
2.非必要的物品不要带入实验室，必须带进的物品应放在不影响实验操作的地方。
3.实验时认真听教师的讲解，仔细观察示范操作。
4.许多微生物有潜在的致病能力。
实验中要严格无菌操作，以免培养的微生物进入外界环境，并保证所培养的微生物不受污染。
①实验室内严禁餐饮。
②实验前洗手并用酒精棉球擦拭手和台面。
③实验操作过程中，要严格进行无菌操作，以防止菌体间交叉感染或致病菌对人体造成危害。
④在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流，要尽量减少走动和讲话，以防止尘埃飞扬和唾沫四溅。
⑤用过的带菌吸管、滴管、玻片、涂布棒和移液器枪头等，用酒精或来苏尔等浸泡以后再进行清洗。
⑥离开实验室之前要用肥皂洗手。
⑦实验室中的菌种和物品等，未经教师允许，不得携带出实验室。
凡需进行培养的材料，都应注明菌种名、接种日期、处理方法及操作者姓名（或组别），放在制定的培养箱中进行培养。
5.如发生培养菌的器皿打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况时，应立即报告指导教师，及时处理，菌液污染实验台面或其他物件时，应及时用3％的来苏尔或5％的石炭酸液擦拭消毒。
6.爱护仪器、设备，严格按照操作规程使用仪器、设备，以确保仪器的安全和学生的人身安全，并做好使用记录，确保仪器的正常使用。
7.按时观察实验现象，认真及时的做好实验记录，对于当时不能得到实验结果而需要连续观察的，则需记下每次的实验结果，以便分析。
清晰填写实验报告作业，科学阐述实验结论。
8.节约水、电，适量取用药品等耗材。
9.实验结束后，应将实验记录交指导教师审阅及检查，经同意后方可结束实验。
实验完毕，认真清洗个人器皿、保养仪器、清理试剂和清洁台面，确保实验以后各种药品和仪器回归原位，台面干净整洁。
10.值日生负责打扫实验室卫生及检查实验室安全状况（门窗、水、电、煤气等）。
实验一微生物学实验基础
一、目的要求
1.熟悉实验室的各种仪器与设备。
2.学会制作棉塞的与包扎玻璃器皿，了解玻璃器皿的洗涤方法。
二、实验材料
实验室内各种仪器、培养皿、三角瓶、试管、纱布、棉花、棉线、牛皮纸、剪刀等。
三、实验内容
（一）微生物实验室常用仪器和设备
1.显微镜
显微镜是微生物实验中常用的仪器，应对它非常的熟悉。
根据光源不同，显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。
前者以可见光（或者紫外光）为光源，后者以电子束为光源。
在我们的实验中常用的是光学显微镜。
光学显微镜有多种，主要有普通光学显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜等。
在我们的实验中最常用的是普通光学显微镜，下面介绍它的主要构造。
（1）普通光学显微镜构造
此类显微镜的构造主要可分为两部分：
机械部分和光学部分。
显微镜的机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配合和灵活调控。
光学部分由物镜、目镜、聚光器、光源、反光镜等组成，它们直接影响显微镜的性能，是显微镜的核心部分。
图1-1显微镜的构造图
（2）普通光学显微镜的使用方法：
①取镜安放：
取镜：
右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立。
（特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜筒中滑脱）。
安放：
放置桌边时动作要轻。
一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂向后，距桌边7～10㎝处，以便观察和防止掉落。
②低倍镜的使用：
观察任何标本都必须先用低倍镜。
放置切片：
升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用压片夹压住载玻片的两端。
调焦：
将要观察的玻片标本放在载物台通光孔的中央，玻片标本两端用压片夹夹紧，再用手沿顺时针方向旋转粗调节器，把镜筒徐徐降到接物镜头差不多接近玻片标本（约半厘米）为止（从侧面观察下降镜筒）。
然后左眼观察，边观察边用调节器将镜筒徐徐上升（逆时针方向旋转粗调节器）直到发现物象，观察清晰为止。
如果不够清楚，可用细准焦螺旋调节（不可以在调焦时边观察边使镜筒下降，以免压碎装片和镜头）。
③低倍镜的观察 由所用的目镜放大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数。
如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节。
④高倍镜的使用
选好目标：
如果要观察视野内某部分更细微的结构，则需要用高倍镜观察。
先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央。
转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜。
再用粗调节器徐徐将镜筒距离调整，至视野中出现物象，然后用细调节器调节到看清物象止（用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片）。
调焦：
在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像。
在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度，可升高聚光器或利用凹面反光镜。
⑤油镜的使用
高倍镜下观察的标本，如果放大倍数还不够，可用油镜，换用前，同样要先在高倍镜下观察，把要观察的部分放在视野的正中央。
观察到清晰的物象之后，在盖玻片上表面的中央滴一小滴香柏油，再换上油镜头，使油镜头与香柏油接触，然后由目镜观察。
一边观察，一边用手稍移动细调节器（切忌用粗调节器）以看清物象。
用油镜观察完毕后，转开油镜，必须用擦镜纸点二甲苯擦去镜头上的香柏油。
下降镜筒，直立反光镜，使光学部件的光线不再对在一条直线上。
应当了解的是，在显微镜中观察到的物象是倒象，因此移动玻片时，应注意移动方向。
如果要使物象左移动就要向右移动玻片，同样要使物象向前移动，就要向后移动玻片。
⑥使用后的整理
观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作。
清洁完毕，再下降镜筒，使物镜和载物台处于最大距离处，然后移动转换器，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，呈“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩，仍用右手握住镜臂，左手平托镜座，按号放回镜箱中。
（3）显微镜的保养
①取送显微镜时，必须右手握住镜臂，左手托住镜座，轻拿轻放。
②显微镜的使用，一定要按实验指导写的方法和步骤，认真仔细去做，不然，容易损坏标本和镜头，又达不到看清物象的目的。
③观察标本时，一定要先用低倍镜观察，再用高倍镜，低倍镜能看清，就不必用高倍镜。
④不能用硬纸擦透镜，必须用干净的擦镜纸，朝一个方向擦拭透镜，以免损坏镜头。
⑤不要随便转动粗细调节器，以免机器损伤，调节失灵。
⑥载物台要保持清洁、干净，不要让水或其他液体（酸、碱或其他化学药品等）流到台上，以免生锈或腐蚀。
⑦避免阳光直接照射，要防潮湿、防灰尘，经常保持镜体和镜体箱的干燥和清洁。
2、高压蒸汽灭菌锅
应用最广、效果最好的灭菌器是高压灭菌锅。
用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、玻璃器皿等的灭菌。
其种类有手提式、直立式、横卧式等（图1-2），他们的构造及灭菌原理基本相同。
图1-2-1手提式高压蒸汽灭菌锅
图1-2-2图1-2-3图1-2-4
立式高压蒸汽灭菌锅普通卧式高压蒸汽灭菌锅圆形卧式高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅主要构造为一双层金属圆筒，两层之间盛水，外壁坚厚，上方或前方有金属厚盖，盖上装有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而锅内压力可升高，其温度也相应增高。
高压蒸汽灭菌锅还装有排气阀，用来调节灭菌锅内蒸汽压力与温度，并保障安全；高压蒸汽灭菌锅上还装有温度压力表，指示内部的温度和压力。
3、超净工作台
是进行微生物无菌操作的工作台，它能在局部形成高净洁度的环境。
其工作原理是借助鼓风机将外界空气强行通过一组过滤器，净化的无菌空气连续不断地进入操作台面，并且台内设有紫外线杀菌灯，可对环境进行杀菌，保证了超净工作台面的正压无菌状态。
4、培养箱
培养箱又称保温箱，是培养微生物的主要仪器。
培养箱一般为方形或长方体形，外壳是喷漆的铁皮或优良塑料材料，内壁为铝板，夹层填充石棉或玻璃棉等绝缘材料以防止温度扩散。
内层底部安装电阻丝用以加热，利用空气对流，使箱内温度均匀。
5、干燥箱
干燥箱又称烘箱，是一种常用于物品干燥的仪器，加热范围一般为30-300℃。
不同类型的干燥箱由于用途、要求不同，构造略有差异。
其构造与传统的培养箱基本相同，只是底层下的电热量大。
主要用于玻璃仪器的灭菌，也可用于洗净的玻璃仪器的烤干。
6、离心机
离心机的主要用途是使液体标本达到离心沉淀的目的。
其原理是利用离心力的作用，将浊液固液分离。
（二）棉塞的制作与玻璃器皿的包扎
1、棉塞的制作
常用的棉塞有试管塞和三角瓶塞，其制作方法基本一致，具体步骤见图1-3。
图1-3棉塞的制作
合格的棉塞不合格的棉塞
图1-2合格与不合格棉塞的对比图
2、玻璃器皿的清洗
玻璃器皿的清洁与否，常会影响实验结果的准确性，所以在使用之前，对玻璃器皿要进行洗涤。
（1）新玻璃器皿新玻璃器皿含有游离碱，初次使用时，应先在2％的盐酸水溶液内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。
（2）带油污的玻璃器皿可先在50g/L的碳酸氢钠液内煮两次，再用肥皂和热水洗涮。
（3）带菌的玻璃器皿
滴管和吸管：
投入3％的来苏水或5％的石炭酸溶液内浸泡数小时或过夜，或经高压蒸汽灭菌后，用自来水及蒸馏水冲净。
载玻片及盖玻片：
先浸入3％的来苏水或5％的石炭酸溶液内，然后用夹子取出经清水洗净，再放入95％的乙醇中，使用时在火焰上烧去乙醇，或用软布擦干使用均可。
其他的带菌玻璃器皿：
应先经121℃高压蒸汽灭菌，20-30min后取出，趁热到处容器内的培养物，再用热水和肥皂水刷洗干净，用自来水冲洗。
3、玻璃器皿的包扎
试验中的各种玻璃器皿常常要进行灭菌处理，为了使灭菌后仍能保持无菌状态、以及防止在灭菌过程中带有样品的玻璃器皿内的蒸汽冲破棉塞，导致器皿内的样品喷溅出来，所以，在灭菌之前对需灭菌的器皿进行包扎。
①培养皿
洗净、干燥后，一般每6套（可视情况改变数量）叠放在一起，用牛皮纸卷成一筒，外面用棉绳捆扎紧，然后进行灭菌后备用。
灭菌后的培养皿，一定要使用时才能打开牛皮纸，以免微生物再次污染。
②试管
洗净、干燥的试管，塞上合格的面塞，面塞入管2/3，管外留1/3，同规格的7支（可视情况改变数量）用棉绳捆扎在一起，试管上半部分外包纱布和牛皮纸，再用棉绳捆扎紧后准备灭菌，灭菌后，用时再打开。
如果试管内有培养基等，应注明。
③三角瓶
三角瓶每个需要单独塞好棉塞，用牛皮纸包扎，用棉绳扎紧后待灭菌。
灭菌后，用时再打开。
如果瓶内有待灭菌的物质如培养基、生理盐水等，应注明。
四、实验报告
1.普通光学显微镜的构造主要分为哪几部分？
2.带菌玻璃器皿怎么洗涤？
实验二染料及培养基的配制技术
一、目的要求
1.掌握常用染料的配制技术。
2.掌握配制培养基的一般方法和步骤，熟悉高压蒸汽灭菌锅的使用。
二、基本原理
染料分为天然染料和人工染料。
天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，他们多从动植物体内提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。
目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。
多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。
为使他们易溶于水，通常制成盐类。
染料可按其电离后染料离子所带的电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四类。
酸性染料：
这类染料电离后染料离子带负电，可与碱性物质结合成盐，如伊红、刚果红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等。
当培养基因糖类分解产酸而是pH下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。
碱性染料：
这类染料电离后带正点，可与酸性物质结合成盐，如美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿、番红等。
在一般情况下，细菌易被碱性染料染色。
中性（复合）染料：
酸性染料和碱性染料的结合物叫中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等。
后者常用于细胞核的染色。
单纯染料：
这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为他们大多都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂类溶剂中，如紫丹类的染料。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。
因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。
但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，再调整pH。
此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，所以，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分或改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。
三、实验材料
1.试剂：
美兰、95%乙醇、氢氧化钾、蒸馏水、碱性复红、石炭酸、结晶紫、草酸铵、碘片、碘化钾、番红、孔雀绿、石炭酸、乳酸（比重1．21）、甘油、棉蓝（即苯胺蓝）；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖、可溶性淀粉、硝酸钾、马铃薯、葡萄糖、琼脂、蒸馏水等。
2.仪器和器材：
电子天平、玻璃棒、烧杯、药匙、称量纸、卫生纸、白色滴瓶、棕色滴瓶、分装漏斗、电磁炉、白瓷杯、试管、三角瓶、高压灭菌锅等。
四、实验内容
（一）几种常用染料的配制
参照附录一、配制吕氏碱性美兰染色液、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、芽孢染色液和乳酸石炭酸棉蓝染色液。
配制完成后，贴上标签，注明染料的种类，配制时间，组别。
（二）培养基配制的一般步骤
1、计算称量：
根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后取少于总量的蒸馏水于白瓷杯中，分别称取培养基成分（除琼脂外），并按顺序逐一加入水中（有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解；对于酵母膏和牛肉膏等原料，在称量后要连同称量纸一起投入水中，待原料被洗下后再将称量纸取出；对于马铃薯培养基，需要先将土豆切成均匀的小块，然后加水煮至沸腾，并维持15min，用纱布过滤，取溶液部分进行培养基的配制）。
2、溶解：
将白瓷杯放在电磁炉上，用文火加热，不断搅拌，并缓慢加入琼脂，待各药品完全溶解后，定容至所需体积。
3、定容：
用蒸馏水补足至所需体积。
4、调节pH：
用精密pH试纸或酸度计进行测定，并用10％的NaOH或10％HCl溶液进行调节，调pH时要尽可能的避免回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。
5、过滤：
液体培养基用滤纸过滤，固体培养基则可以用4层纱布趁热过滤。
但是供一般使用的培养基，这步可以省略。
6、分装：
①分装三角瓶：
将融化的培养基倒入三角瓶中，其装量以不超过三角瓶总容量的3/5为宜。
②分装试管：
将融化的培养基加至漏斗上，分装时左手并排拿着数根试管，右手控制弹簧荚开关（如图2-1），将培养基依次加入各试管。
用于制作斜面培养基时，装量不超过试管高度的1/5，分装时谨防培养基沾在管口上，从而造成污染。
7、加塞，包扎，贴标签（标签上要注明培养基的名称、组别或个人名字、日期等）。
8、灭菌（常用高压蒸汽灭菌）。
图2-1分装示意图
9、无菌检查：
检查的一般方法是放在37℃培养箱中培养过夜，如果没有染菌，则证明灭菌彻底，反之，则需要重新灭菌。
按照上述步骤，参照附录二的配方，配制牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏Ⅰ号培养基、马铃薯培养基。
（三）灭菌（高压蒸汽灭菌）：
高压蒸汽灭菌锅一旦发生事故，后果非常严重，所以要严格按照操作说明进行每一步的操作，并要注意以下的注意事项：
1、灭菌之前首先要检查灭菌锅的水是否加好；
2、灭菌锅内装的东西不可过满，否则会导致灭菌不彻底；
3、灭菌锅盖一定要拧紧，防止热蒸汽冲开锅盖而发生事故。
4、灭菌过程中，要有专人看守，一旦发现故障，应立即关闭电源，并报告指导教师；
5、灭菌完毕后，应等到压力降至零以后，方可打开锅盖。
五、实验报告
1．为什么一般情况下，细菌易被碱性染料染色？
2．简述配制培养基的一般步骤。
3．培养基配好后，为什么必须立即灭菌?
如何检查灭菌后的培养基是无菌的?
4．简述高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。
实验三细菌的简单染色及形态观察
一、实验目的
1.学习微生物涂片、染色的基本技术。
2.掌握细菌的简单染色法。
3.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞非常小，又因为其含水量高
（一般在80％～90％以上），对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，与周围背景没有明显的明暗差，所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算活菌外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察，但不能辨别其构造。
染色前必须固定细菌。
其目的有二：
一是杀死细菌并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
三、实验材料
1.菌种：
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
2.染色剂：
吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液）、石炭酸复红染液。
3.仪器或其他用具：
显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水等。
四、实验步骤
1、涂片：
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水（或蒸馏水）于载玻片中央，用接种环以无菌操作（图3-1），分别从枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取1～2环直接涂于载玻片上。
注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
2、干燥：
室温自然干燥。
也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。
但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
3、固定：
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。
图3-1涂片、干燥和热固定。
4、染色：
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。
吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。
5、水洗：
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要水流直接冲洗涂面。
水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
6、干燥：
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。
7、镜检：
涂片干后镜检。
涂片必须彻底干燥后才能用油镜观察，否则可能导致菌体脱落。
图3-1无菌操作示意图
图解：
（1）将菌种斜面放在左手中指和食指之间，大拇指揿住试管。
并使斜面向上，以便观察。
（2）右手转动棉塞，便于拔出。
（3）右手拿接种针，使其直立于火焰中，将接种针的电热丝部分烧红。
（4）用小指与手掌夹取棉塞。
在拔棉塞时用力不宜过猛，以免将外界杂菌带入管内。
还应该注意不要将棉塞和已烧过的接种针碰到物体上。
试管也应保持水平位置，并在火焰附近。
（5）取出棉塞后，将管口均匀通过火焰。
（6）将接种针伸入菌种管内，先与斜面顶端的培养基接触，使其冷却，然后在斜面上挑取菌体。
（7）将管口均匀通过火焰，立即塞上棉塞。
（8）用过的接种针必须在火焰中灼烧后，才能放置它处，一是防止菌种污染环境，另外，还可以防止菌种间的交叉污染。
五、实验报告
绘制单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，标明视野，并注明其放大倍数和菌种类别。
实验四细菌的革兰氏染色
一、实验目的
1．了解细菌的革兰氏染色法的原理。
2．掌握革兰氏染色法的主要步骤
二、实验原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gramstain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：
染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G－表示。
细菌对于革兰氏染色的不同图4-1革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁图
反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：
碱性染料（basicdye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorisingagent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystalviolet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G－两大类群，常用的复染液是番红。
三、实验材料
1．菌种：
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2．染液：
草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红液。
3．其他：
显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。
四、实验步骤（见图4-2）
1、涂片：
将培养14-16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2、染色
（1）初染：
加草酸铵结晶紫一滴，约1分钟，水洗。
（2）媒染：
滴加碘液冲去残水，并覆盖约1分钟，水洗。
（3）脱色：
将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染：
用番红液染色1-2分钟，水洗。
（5）镜检：
干燥后，置显微镜下观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细
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