动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.docx
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动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测
一、前言
脱氧核糖核酸
脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。
有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。
DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。
DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。
当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。
较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。
在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。
对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：
G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。
染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。
脱氧核糖核酸的结构
DNA的结构：
DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。
DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP脱氧鸟苷）。
而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。
读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA（信使RNA）的核酸分子。
DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。
大多数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。
DNA有环形DNA和链状DNA之分。
在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。
在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。
40年代后期，查加夫（E.Chargaff）发现不同物种DNA的碱基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（A=T），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘DNA的结构。
浓盐法从动物组织中提取DNA
核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14M的盐溶液中溶解度很低，而RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。
肝脏细胞
肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。
人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。
肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。
肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:
如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。
二、实验目的
1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术
三、实验原理
核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14M的盐溶液中溶解度很低，而RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。
四、实验器材和材料试剂
实验器材：
①匀浆器
②量筒
③离心机
④离心管
⑤试管
⑥吸管
⑦恒温水浴锅
实验材料：
①猪肝
实验试剂：
①0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）
②95%乙醇（A.R.）
③NaCl固体（A.R.）
④5%SDS溶液（5gSDS定容至100ml）
⑤V（氯仿）：
V（异戊醇）20：
1的混合液
五、实验操作
1.称量
①称取一定质量的猪肝，加入2倍肝重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎（已完成）。
2.提取DNA
①量取肝糜4ml于10毫升离心管，在4000r/min下离心10min，沉淀中再加入8ml缓冲液于4000r/min离心5min；
②弃上清，取沉淀；
③将沉淀用10ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5ml氯仿-异戊醇混合液、1mlSDS，振荡30min（保鲜膜封口）；
④缓慢加入固体NaCl（约0.9g），使其最终浓度为1mol/L；
⑤将溶液分装到2个10毫升离心管中，在4000r/min离心5min，取上清水相；
⑥在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品；
⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中。
3.标准曲线的绘制
按下表加入各种试剂，混匀，于60℃恒温水浴锅45min，冷却后，在595nm波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制作标准曲线。
0
1
2
3
4
5
标准DNA溶液/ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水/ml
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
二苯胺试剂/ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A595nm
4.样品的测定
将DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。
然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于60℃恒温水浴锅45min，冷却后，595nm波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量（ug）。
5.计算100g猪肝中DNA含量
w=m1/m2×100%
w：
DNA的质量分数（%）
m1：
样液中测得的DNA的质量（ug）
m2：
样液中所含样品的质量（ug）
六、实验数据处理
1.标准曲线
0
1
2
3
4
5
标准DNA溶液/ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水/ml
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
二苯胺试剂/ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A595nm
0
0.039
0.09
0.146
0.197
0.249
DNA含量/ug
0
80
160
240
320
400
2.实验结果处理
猪肝质量为2.04g
DNA提取液体积为12.53ml
序号
1
2
3
A595nm
0.102
0.102
0.101
平均A595nm
0.102
样液中DNA含量/ug
171.4
样液中样品质量/g
0.1628
根据公式
w=m1/m2×100%
得：
w=0.1053％
则100g猪肝中DNA含量为：
w×100=0.1053g
七、思考题
1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？
答：
①柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂，也是pH缓冲溶液；
②SDS是表面活性剂，可以让蛋白质与DNA分开；
③氯仿是有机溶剂，可以使蛋白质聚集沉淀，便于分离出去；
④异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；
⑤氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；
⑥NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的环境中DNA核蛋白能溶解，RNA核蛋白则溶解度很低，可以利用这一性质分离两种核酸。
八、实验注意事项
1.DNA主要集中在细胞核中，因此，通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料，小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而DNA含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备过程中DNA被降解的可能性相对较低，所以是制备DNA的良好材料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备DNA常用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。
2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施：
整个过程必须在低温下进行，可加入某些物质抑制核酸酶的活性，如柠檬酸钠、EDTA、SDS等，EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。
3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：
氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚，并释放出核酸。
4.使用离心机时，对称放置的离心管必须用天平调平衡。
5.避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。
九、实验结果误差分析及讨论
经过对本次实验结果进行分析，得出100g猪肝中DNA含量大约为0.1053g的结论，在上网查阅相关资料后发现：
猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。
由此可知，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术，基本达到了本次实验的目的。
但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于某些误差导致，在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差，经分析得出以下几点：
①在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中，由于猪肝组织表面较滑不易磨碎，且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留，因此可能导致猪肝中DNA提取不充分，致使实验数据较理论值偏低；
②研磨过程中，可能由于操作不当，导致部分液体溅出，因此可能使得提取液中部分DNA损失，导致实验数据偏低；
③在粗提取DNA操作中，频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内，可能有极小部分DNA提取液未倒净，残留在仪器壁上损耗掉，导致实验误差；
④在使用移液枪的过程中，可能因为操作不当或移液枪经常错误使用，出现仪器误差，导致吸取的DNA样液不精确，出现实验误差；
⑤在水相中加入乙醇析出DNA时，不是所有DNA均析出，有小部分依旧融在溶液，导致提取出的DNA含量偏低；
⑥标准曲线制作过程中出现些许误差；
总的来讲，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术，基本达到了本次实验的目的。
在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性，严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行，保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低，尽可能达到预期的实验效果，完成自我的学习及锻炼过程。
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