高级生化复习提纲.docx
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高级生化复习提纲
第一编概述
第一章生物大分子物质的制备
1、生物大分子：
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。
常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂质、糖类等。
（名解）
有效成分：
指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。
有效成分具有含量少和稳定性差的特性。
2、分离纯化的步骤与原则：
（要有所论述）（问答）
层析法
生物组织→→提取液→→粗产品→电泳法→结晶
超离心法
透析和超滤
│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│
材料选择与处理盐析（硫酸铵盐析）依据原理：
细胞破碎（机械等电点沉淀分子大小、溶解度
破碎溶账和自溶、有机溶剂沉淀电荷性质、吸附性质
酶解、化学处理）离心生物亲和力
3、分离纯化的注意事项：
（填空）
基本原则：
防止生物分子变性、降解
1）控制适当的pH；2）控制低温；3）注意提取过程中的溶液环境（成分的变化）；4）防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
4、材料的选择原则：
（1）含量多、稳定性好；
（2）来源丰富、保持新鲜；（3）工艺简单、有利用价值。
5、测定方法的确立：
（填空）
一、目的与要求
目的：
监控整个制备过程，评价方案的合理性
要求：
专一、准确、灵敏、简便
二、常用的测定方法
1.光谱法（紫外光谱法、可见光谱法、荧光法、浊度法）
2.电化学法3.生物活性检测法4.免疫分析法5.生物传感器
紫外光谱法：
（填空）
A.测定核酸含量
当A260=1时：
双链DNA50μg/ml；单链DNA37μg/ml；
单链RNA40μg/ml
A260/A280:
纯DNA=1.8;纯RNA=2.0
样品中污染蛋白质或酚类等物质时比值减小
B.测Pro的含量及纯度:
A280的决定性Aa是Trp（色Aa）和Tyr（蛋Aa）
荧光光谱法：
荧光法的精确性、重复性和灵敏度好过吸收光谱法。
GOT
无荧光的物质想法偶联上荧光物质即可。
如：
NADH/NADPH有荧光，通过酶联反应引入荧光物质等都是常用方法（转氨酶、甲胎蛋白-AFP）（Transaminase,GOT）活力测定，是采用于苹果酸脱氢酶（malic-dehydrogenase,MDH）相偶联反应进行：
MDH
天冬氨酸+α-酮戊二酸⇋草酰乙酸+谷氨酸
草酰乙酸+NADH+H+⇋L-苹果酸+NAD+
每生成一分子草酰乙酸就消耗一分子的NADH，这样GOT活力就可以通过测定NADH在340nm消光值的下降来求得。
6、细胞破碎：
（填空）
有效成分的存在：
胞外（基因工程-胞内转胞外）;胞内:
游离态;结合态
一、机械破碎1.研磨法2.组织捣碎器法3.超声波法4.压榨法5.冻溶法
二、溶胀和自溶
三、化学处理（脂溶性溶剂、表面活性剂）
四、生物酶降解（溶菌酶、蛋白酶、蜗牛酶）
7、抽提：
（名解）
抽提：
用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。
用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。
8、理想抽提液的条件
A.对有效成分溶解度大，破坏作用小B.对杂质不溶解或溶解度很小
C.来源广泛、价格低廉、操作安全
9、抽提有效成分的影响因子
1）pH值：
偏离等电点碱性—pHpI
2）溶剂的极性和离子强度：
（蔗糖、甘油、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺降低离子强度）（加入NaCl、NH4Cl升高溶液离子强度,盐析盐溶）
3）水解酶：
（胰岛素与胰蛋白酶原共存于胰腺）
（1）加入PMSF等酶抑制剂；
（2）调节抽提液的极性、离子强度、PH值。
4）温度：
低温（0-4度）有利，但有例外
5）搅拌：
易产生泡沫导致蛋白质变性（气泡界面扭力引起）；温和搅拌可增加溶解度
6）氧化：
巯基易被氧化，常用抗氧化剂：
巯基乙醇，半胱氨酸，谷胱甘肽，维C，二硫苏糖醇（多酚氧化酶）；苯基硫脲，可抑制酚类物质被多酚氧化酶氧化为有色的醌类物质）
7）金属离子：
蛋白-金属离子沉淀，EDTA络合剂（1-3mmol/L）
8）抽提液与抽提物的比例：
（5:
1）
10、浓缩:
（填空）
1）沉淀法:
中性盐，有机溶剂（经透析，凝胶过滤脱盐）
2）吸附法:
干胶（对有效成分性质无影响，吸附力不强）
3）超过滤法：
加压过滤（小量可手工，半透膜孔径大小掌握好）
4）透析法：
一定浓度的PEG（30%）、甘油（50%）
5）减压蒸馏法：
（适用于常温下稳定的物质）
6）冰冻干燥法：
冰冻抽提液（固）在真空状态下直接变为气体。
有效成分几乎不损失。
适用于量小、纯化的最后步骤。
11、纯化方案的设计与评价
一、纯化方案的设计
纯化方法的选择依据：
有效成分与杂质的理化性质差异，如溶解度、电荷性质、分子量大小、对配体亲和力的差异等
原则：
先用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法
后用精确、费时和需样品量少的方法，同一方案中忌重复使用一种分离方法
二、纯化方案的评价
对每一次收集的溶液进行有效成分多指标测定：
A含量测定（蛋白总量）（总活力）
B比活力（活力单位数/毫克蛋白）
C纯化倍数（每步比活力/粗抽提液比活力）
D收得率（每步总活力/粗抽提液总活力*100%）
各指标需综合考虑
第二编纯化方法
第二章沉淀法
1、分级沉淀：
从溶液中分步沉淀而分离物质的方法。
可以用改变溶液的离子强度、pH或介电常数等，使溶液中不同的物质按溶解度变化的顺序逐步沉淀出来。
常用于大分子物质的分离。
2、盐析曲线的制作：
（问答）
1）取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调pH至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵。
2）第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。
3）以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。
4）如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分.
5）将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图.
6）在此曲线的基础上，参照表2-3的分级试验方法，根据材料来源的难易程度、有效成分纯度和得率要求等做出判断。
3、盐析影响因子：
1）盐析常数Ks：
表示有效成分溶解度降低的速率与盐浓度之关系
ks值大，说明溶解度降低的速度随盐浓度的增加而快速降低。
其分级范围就窄，盐析效果就好。
它与蛋白质本身的性质、溶液的pH、温度、盐的种类等有关。
2）盐分级范围的差异性：
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的Ks值都很大，且盐析范围（盐离子强度）差异明显，则分离效果好；若Ks值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果不好。
3）PH和盐浓度：
调至待沉淀分离物的等电点
4）Pro的纯度和浓度（0.2-2%）Pro浓度越高，共沉淀现象（一种沉淀物从溶液中析出时，引起某些可溶性物质一起沉淀的现象）越明显。
4、有机溶剂沉淀法：
常用：
甲醇、乙醇、丙酮（有机溶剂使溶液极性减小，导致蛋白质表面极性基团排斥内陷，疏水基团外露因而聚集变性沉淀）
注：
A、低温与预冷B、适量中性盐可减少蛋白质的变性
C、多价阳离子有利于某些蛋白质的沉淀
5、核酸的分离纯化：
有机溶剂法：
用苯酚、氯仿（蛋白质变性剂）反复处理，可使核酸-蛋白分离。
离心后收集上层含核酸水相。
经典方法：
饱和酚→酚-氯仿-异戊醇→氯仿-异戊醇→乙醚
DNA与RNA的分离（盐析法）：
DNA溶于1~2mol/LNaCl溶液；RNA溶于0.14mol/LNaCl溶液
核酸的沉淀：
有机溶剂（加盐）
A、乙醇-盐溶液
DNA--（浓度>0.1μg/ml）+0.1mol/LNaCl（1/10体积加入）—用2倍体积冷乙醇
RNA--（浓度>0.1μg/ml）+0.1mol/LNaCl（1/10体积加入）—用2.5倍体积冷乙醇
（沉淀时间取决于核酸分子大小、浓度和温度）
B、异丙醇
DNA（大分子rRNA）+0.3mol/LNaAc+0.54~1倍体积异丙醇
第三章吸附层析
1、常用术语：
1）固定相：
固定相由层析基质组成。
其基质包括：
固体物质（如吸附剂、离子交换剂），液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2）流动相：
在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂（即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液）。
在薄层层析时，流动相又称展层剂。
3）层析：
以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。
4）操作容量：
即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。
（mmol/g,mg/g,mmol/ml,mg/ml）其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。
5）床体积（Vt）：
通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）。
Vt是基质的外水体积（V0）和内水体积（Vi）以及自身体积（Vg）的总和，即:
Vt=V0+Vi+Vg
6）洗脱体积（Ve）：
洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。
用Ve表示。
7）外水体积（V0）：
外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
8）内水体积（Vi）：
内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
9）基质体积（Vg）：
基质体积是指基质自身所具有的体积。
V0、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。
10）膨胀度：
在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示。
即每克溶胀基质所具有的床体积。
Vβ=Vt/g
11）分配系数和迁移率
分配系数:
是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。
迁移率:
是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移
动距离之比值，常用Rf表示。
K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。
不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。
几种物质之间的分配系数或迁移率,其差异程度越大，分离效果就越好。
一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。
2、吸附层析：
以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。
吸附-溶解-再吸附
层析柱、吸附剂的用量、装柱、上样洗脱、绘制出洗脱曲线、吸附剂的再生
装柱和上样洗脱（熟悉）：
装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱后，层析柱中基质应符合如下标准：
填装均匀、松紧一致、没有气泡。
分为干装法和湿装法。
当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（其体积用液面距固定相表面的高度约5cm计），并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
3、分配层析：
分配色谱是色谱法的一种，利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。
分配系数Kd=CA/CB物质在互不相溶的A相和B相中的浓度。
第四章疏水层析
1、疏水层析与吸附层析的区别：
疏水层析吸附层析
固定相亲水性或疏水性基质颗粒状极性与非极性吸附剂
+疏水性基团（配体）
流动相洗脱剂由高盐→低盐极性物：
盐梯度；
非极性：
有机溶剂
极性大→小极性小→大
洗脱物极性大→小极性小→大
2、疏水层析与反相层析：
疏水层析与反相层析分离生命物质的依据是一致的，即：
视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，将有效成分分离出来。
反相层析与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类物质具较大吸附力;欲将吸附物解析下来，须用含有有机溶剂的流动相（降低极性）通过，方可见效。
由于洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变性，因此较适合分离纯化小分子量的肽类和辅基等物质。
疏水层析（所用基质的性能和反向层析不同）：
与基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物容易被解吸下来。
较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的物质。
这不仅使有效成分的纯度得到提高，而且还保持了其原来的结构和生物活性。
第五章离子交换层析
1、离子交换剂
由三部分组成：
基质+电荷基团+反离子
根据基质的组成和性质，可将其分成两大类：
1）疏水型离子交换剂:
其基质是人工合成与水结合力较小的树脂
⑴阳离子交换剂：
反离子带正电荷，分强酸型、中强酸型、弱酸型
⑵阴离子交换剂：
与负离子或基团交换，有强碱、中强碱、弱减型
特点：
交换容量大、机械强度大、流动速度快，适宜分离小分子物质，少数新品可用于蛋白质分离
2）亲水型离子交换剂:
其基质是天然或人工合成亲水性大的物质
⑴纤维素离子交换剂：
以微晶纤维素为基质，有酸碱性不同型号
⑵交联葡聚糖：
以交联葡聚糖G25和G50为基质，（阳性和阴性）
⑶琼脂糖离子交换剂：
以交联琼脂糖CL-6B等为基质（阴阳型号）
2、膨胀度与交联度（交联剂在基质中所占百分数）的关系：
交联度大，网孔小，膨胀度小，吸水量小;
亲水性基质膨胀度大;交换剂的电荷强度强，膨胀度大;带同种电荷或解离度大时（pH远离pK）膨胀度大;交联度越大，各因素影响越小。
3、影响交换容量的因素：
筛孔：
交联度小，筛孔大，有利于提高生物大分子的交换容量
离子强度：
离子强度增大，有效交换容量减小（洗脱）
pH值：
使离子交换基团解离度增加的pH变化有利于提高交换容量
4、离子交换剂与缓冲液的选择：
一）离子交换剂的选择
1）正确选择阴阳离子交换剂若被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；若带负电荷，应选择阴离子交换剂；若被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定PH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。
2）强弱型离子交换剂的选择生物大分子常用弱酸碱性离子交换剂
3）不同离子型交换剂的选择为提高交换容量，一般选择结合力较小的反离子；强酸强碱型分别选择H型和OH型；弱酸弱碱型分别选择Na和Cl型
4）不同基质的选择生物大分子宜选用亲水性基质离子交换剂
二）缓冲液的选择
1）缓冲液的pH和离子强度直接影响分离物的交换容量
2）起始缓冲液的pH和离子强度应有利于样品中的有效成分与离子交换剂结合，而杂质不能结合。
或相反。
离子强度以0.1为宜。
用阴离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值高一个单位
用阳离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值低一个单位
3）洗脱液：
离子强度应高于缓冲液
阳离子交换剂↗
pH（逐渐接近pI）
阴离子交换剂↘
4）缓冲液选择的关键在于了解有效成分的等电点，而未知样品则需通过试验来确定（试管法，掌握）
第六章凝胶过滤
1、凝胶过滤与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及区别：
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原理在于凝胶（作层析介质，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质被排阻在外，当一混合溶液通过凝胶层π析柱时，溶液中的物质就按分子质量筛分开了。
分配系数（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）Kav，其大小依赖于凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）。
Kav=Ve-V0/Vt-V0。
①计算法Vt=πr2h,其中r为层析柱半径，h为凝胶床高度。
②测量法Vt=V0+Vi+Vg，V0为外水体积，Vi为内水体积，Vg为凝胶颗粒实际占有体积。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAEG
电泳是带电离子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。
电泳技术是指运用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。
PAGE是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶（PAG）作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性）或连续体系（一层凝胶、一种pH和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。
第七章亲和层析
1、亲和层析的原理：
原理：
利用生物大分子的特异的生物学性质---专一地对某一种或某一类物质可通过次级键结合的特性（亲和特性）进行纯化的方法，与层析法结合起来就是亲和层析法。
亲和层析法使生物大分子的提纯变得简单、迅速和高效。
亲和层析的亲和力就像抗原-抗体、激素-受体、酶-底物间的作用力，是多种次级键共同作用的结果。
2、怎样提高吸附剂的操作容量：
影响操作容量的因素：
配体性质、吸附剂中配体的固化量、配体的位阻效应、基质的多孔性、操作条件
1）在配体和基质间引入“手臂”：
在配体和基质间特别是在小分子配体和基质间引入适当长度的手臂，使配体离开基质的骨架，或许可以减少基质的立体位阻效应，增加配体的活动度及深入溶液的深度。
但是手臂并非越长越好，过长易弯曲折叠，导致吸附容量降低。
2）增加配体取代的程度：
想法增加基质上配体的浓度，方法有：
①配体量一定时，增加基质活性基团（活化基质时提高pH，溴化氰用量）②基质活化度一定时，提高反应pH值或增加配体浓度。
3）配体与基质以最少的键连接：
当配体是蛋白质或多肽时，以较少的共价键连接到载体上有利于保持蛋白质的高级结构和生物学功能，即有利于提高吸附作用（操作容量）。
4）基质多孔性的影响：
基质引入配体后，其多孔性可降低，其中生物胶降低厉害，比较而言，琼脂糖的多孔性稳定性较好，较适合生物大分子的吸附。
5）其他：
样品浓度、pH、离子强度、上样、洗脱速度（反应时间）
第八章聚焦层析
1、聚焦层析：
由等电聚焦法发展而来，其依据是分离物的等电点差异和离子交换行为。
流动相：
多缓冲剂；固定相：
多缓冲交换剂
2、PH梯度：
等电聚焦pH梯度的形成—正极-硫酸，阴极-NaOH，载体两性电解质在两极间排布，停在各自pI=pH处，聚焦完成，电流为零。
例如：
当柱中装多缓冲交换剂（阴离子交换剂）PBE94（固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含polybuffer96的多缓冲剂作流动相（调pH到6）进行洗脱。
随着洗脱的进行，流动相中物质按酸性最强---最弱的顺序，先后与柱中碱性最强-最弱的多缓冲交换剂结合发生中和作用，使柱内每点pH值从高到低（从9--6）逐渐下降，经过一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6—9的梯度，此梯度是在洗脱过程中自动形成的。
但是随着洗脱的进行，pH梯度会逐渐下行，从底部流出的pH从9降至6，最终恒定于此值，此时层析柱的pH梯度就消失了。
3、聚焦效应：
蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应，pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。
第九章蛋白质的大规模分离纯化
1、常用双水相体系：
聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dextron）、PEG/磷酸盐
第一十章常规电泳技术
1、PH连续/非连续电泳：
缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同/不连续，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应（后者还具有浓缩效应）。
2、自由流动电泳（无支持物）（又称移动界面电泳法）：
不含支持物的电泳。
溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电泳，适用于高分子的检测，但不易完全分离。
3、区带电泳：
在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质（醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等）使具有不同泳动速率的各组分形成各自的区带。
4、膜固定PH等电聚焦：
（没找到）
最大特点：
两膜ph差值越小，分辨率越高。
第十一章离心技术
抗体酶
第三编鉴定方法
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