细胞治疗实验室基本工艺作业流程.docx
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细胞治疗实验室基本工艺作业流程
细胞诊疗试验室工艺步骤
细胞诊疗试验室工艺步骤按种类分为：
一、试剂耗材入库统计，试剂耗材使用统计，试剂配制统计，配制试剂使用统计。
入库需要统计产品名称、批号、使用期、数量、存放位置、入库时间。
试剂耗材使用统计包含名称、批号、用途，时间。
试剂配制统计包含原料名称、批号，配制试剂时间、使用期、批号。
配制试剂使用统计包含使用时间、批号、用途。
二、试验统计，包含采血、分血、细胞接种、补液、质检、回输。
采血有2个信息试验室需要统计，包含浓缩白细胞体积和血浆体积。
分血有需要统计使用分离液量和单个核细胞数量。
细胞接种需要统计DC、CIK、CD3AK、γδT、NK等细胞接种数量、培养基体积、细胞因子添加量。
补液需要统计补液时间和体积。
质检需要做细菌真菌培养、内毒素检测、革兰氏检测，统计做这些质检时间。
回输需要统计回输细胞种类、时间、细胞体积、细胞数量。
三、细胞检测统计，包含细菌真菌培养，内毒素检测，革兰氏检测，流式检测。
统计内容包含样品起源、检测时间、结果、检测人。
四、清洗消毒统计。
包含清洗消毒时间、方法、消毒使用期。
细胞培养步骤图
NO：
_
自体细胞制剂制备统计
患者基础情况
采血日期：
姓名
年龄
性别
科室
病案号
主管医生
床号
传染病
临床诊疗
病理切片
细胞制备标准操作统计
分血
数量
单位
日期
操作人
复核人
备注
自体血浆体积
ml
白细胞体积
ml
Ficol体积
ml
批号：
PBMC总量
×109
DC细胞制备
数量
单位
日期
操作人
复核人
备注
1、PBMC用量
×108
2、铺瓶（板）
瓶（板）
3、加DC培养液体积
ml
4、DC诱导因子（100X）
ml
批号：
5、第五天加DC成熟剂1（100X）
ml
批号：
6、第六天补加DC成熟剂2（100X）
ml
批号：
7、第七（八）天搜集DC
×107
CIK细胞制备
数量
单位
日期
操作人
复核人
备注
1、添加IFN-r
IU
2、PBMC用量
×108
3、接种体积
ml
4、添加CIK混合因子（100X）
ml
批号：
5、补液
第1次
ml
第2次
第3次
第4次
第5次
第6次
CD3AK细胞制备
数量
单位
日期
操作人
复核人
备注
1、添加CD3AK混合因子（100X）
ml
批号：
2、PBMC用量
×108
3、接种体积
ml
4、补液
第1次
ml
第2次
第3次
第4次
第5次
γδT细胞制备
数量
单位
日期
操作人
复核人
备注
1、PBMC用量
×109
2、接种体积
ml
3、添加γδT混合因子（100X）
ml
批号：
4、补液
第1次
ml
第2次
第3次
第4次
第5次
NK细胞制备
数量
单位
日期
操作人
复核人
备注
1、PBMC用量
×108
2、接种体积
ml
3、添加NK细胞混合因子（100X）
ml
批号：
4、补液
第1次
ml
第2次
第3次
第4次
第5次
细胞冻存及复苏标准操作统计
细胞冻存标准操作统计
日期
编号
细胞
类型
细胞
数量
冻存数量（支）
冻存液
编号
存放
位置
操作人
复核人
备注
细胞复苏标准操作统计
日期
编号
细胞
类型
细胞
数量
复苏数量（支）
复苏
用途
存放
位置
操作人
复核人
备注
自体细胞制剂回输统计
姓名
年龄
性别
科室
病案号
床号
次数
日期
细胞类型
批号
体积（ml）
回输方法
运输人
接收人
复核人
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
自体细胞制剂检控统计
次数
细胞
外观
细菌真菌
培养
革兰氏染色
细菌内毒素
最终检定结果
存活率
数量
操作人
复核人
回输细胞批号
均匀悬浊液，无异物
第一次回输前3天
每次回输当日
每次回输当日
需经检定合格后方可回输
存活率≥85%
1
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
2
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
3
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
4
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
5
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
6
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
7
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
8
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
9
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
10
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
11
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
12
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
13
□是□否
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□阳性□阴性
□合格□不合格
CIK细胞培养标准操作步骤
一、溶液配置
1、热灭活自体血浆制备：
将自体血浆装在无菌离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。
2、IFN-r母液（1000X）：
用无血清培养基配成100万IU/ml。
3、CIK混合因子（100X）：
冰箱4度保留。
4、CIK完全培养基：
无血清培养基加1%-2%热灭活自体血浆。
二、CIK细胞制备：
1、血细胞单采机采集病人浓缩白细胞和血浆（80-100ml）。
2、准备2支50ml离心管，每管加入淋巴细胞分离液20ml。
3、将浓缩白细胞从血袋中取出，直接等量加到上述2支50ml离心管淋巴细胞分离液上面，转离心25分钟，升降速调到最低值。
4、取出上层血浆搜集到一支50ml离心管中，余下部分除红细胞外全部搜集到2支50ml离心管中，加生理盐水到50ml，1500转离心10分钟，去除上清，合并2支管内细胞到一支50ml离心管中，加50ml生理盐水，取20ul样品用于计数，1200转离心7分钟，去除上清。
5、全部血浆留出12支5ml用于回输，其它全部56摄氏度灭活40分钟，灭活完成后2500转离心10分钟，搜集上清备用。
6、将细胞用CIK完全培养基配成1X106/ml，加入IFN-r母液至1000IU/ml，接种1个细胞培养袋，袋内加200mlCIK完全培养基。
7、二十四小时后，按1:
100加入CIK混合因子。
8、第5天，按4倍稀释添加含300IU/mlIL-2CIK完全培养基。
9、第8天到第9天，按2倍稀释添加含300IU/mlIL-2CIK完全培养基。
同时取样做细菌真菌培养。
10、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检验。
11、等拿到细菌真菌培养结果后，检验全部结果是否为阴性。
CIK培养到第10天-15天内回输。
12、回输时搜集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，搜集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。
13、将搜集到细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，2万IUIL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。
14、将完成细胞悬液封好瓶口，查对病人姓名、性别、年纪、住院号、细胞数、无菌结果、病区及诊疗项目，确定无误后，贴上标签，送病区进行回输。
DC细胞培养标准操作步骤
一、溶液配置
1、热灭活自体血浆制备：
将自体血浆装在无菌离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。
2、DC基础培养基：
用无血清培养基+2%热灭活自体血浆。
3、DC诱导剂（100X）：
冰箱4度保留。
4、DC培养基：
DC基础培养基加入DC诱导剂
4、DC成熟剂1（100X）：
冰箱4度保留。
5、DC成熟剂2（100X）：
冰箱4度保留。
二、DC细胞制备：
1、取PBMC，加入IMDM培养基配成5X106/ml细胞悬液，按每孔3ml接种到6孔板内，放入培养箱。
2、2小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁单核细胞（体积比其它细胞稍大），每孔加入3mlDC培养基。
3、第5天，按每孔30ul加入DC成熟剂1，取样做细菌、真菌培养。
4、搜集细胞前12小时每孔加入30ulDC成熟剂2，同时取样送检做革兰氏染色检验。
5、DC培养到第7-8天，搜集细胞，用生理盐水洗3次，分成4份，其中一份用于当日回输，其它冻存在-80度冰箱中。
6、将生理盐水清洗过DC细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。
7、将完成细胞悬液封好瓶口，查对病人姓名、性别、年纪、住院号、细胞数、无菌结果、病区及诊疗项目，确定无误后，贴上标签，送病区进行回输。
CD3AK细胞培养标准操作步骤
一、溶液配置
1、热灭活自体血浆制备：
将自体血浆装在无菌离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。
2、CD3AK混合因子（100X）：
冰箱4度保留。
3、CD3AK完全培养基：
无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆+CD3AK混合因子。
二、CD3AK细胞制备：
1、PBMC用CD3AK完全培养基配成1X106/ml，接种培养瓶或培养袋培养。
2、第5天，按4倍稀释添加CD3AK完全培养基。
3、第8天到第9天，按2倍稀释添加CD3AK完全培养基。
同时取样做细菌真菌培养。
4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检验。
5、等拿到细菌真菌培养结果后，检验全部结果是否为阴性。
CD3AK培养到第10天-15天内回输。
6、回输时搜集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，搜集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。
7、将搜集到细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，2万IUIL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。
8、将完成细胞悬液封好瓶口，查对病人姓名、性别、年纪、住院号、细胞数、无菌结果、病区及诊疗项目，确定无误后，贴上标签，送病区进行回输。
γδT细胞培养标准操作步骤
一、溶液配置
1、热灭活自体血浆制备：
将自体血浆装在无菌离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。
2、γδT混合因子（100X）：
冰箱4度保留。
3、完全培养基：
无血清培养基1%-2%热灭活自体血浆。
二、γδT细胞制备：
1、将PBMC用完全培养基配成2X106/ml，加入混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。
2、第5天，按2倍稀释添加含400IU/mlIL-2完全培养基。
3、第8天到第9天，按2倍稀释添加含400IU/mlIL-2完全培养基。
同时取样做细菌真菌培养。
4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检验。
5、等拿到细菌真菌培养结果后，检验全部结果是否为阴性。
γδT培养到第10天-15天内回输。
6、回输时搜集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，搜集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。
7、将搜集到细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。
8、将完成细胞悬液封好瓶口，查对病人姓名、性别、年纪、住院号、细胞数、无菌结果、病区及诊疗项目，确定无误后，贴上标签，送病区进行回输。
NK细胞培养标准操作步骤
一、溶液配置
1、热灭活自体血浆制备：
将自体血浆装在无菌离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。
2、NK细胞混合因子（100X）：
冰箱4度保留。
3、完全培养基：
SCGM无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆。
二、NK细胞制备：
1、将PBMC用完全培养基配成1X106/ml，加入NK细胞混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。
2、第5天，添加2倍量完全培养基，加入500IU/mlIL-2。
3、第8天到第9天，按2倍稀释添加含500IU/mlIL-2完全培养基。
同时取样做细菌真菌培养。
4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检验。
5、等拿到细菌真菌培养结果后，检验全部结果是否为阴性。
NK培养到第10天-15天内回输。
6、回输时搜集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，搜集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。
7、将搜集到细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。
8、将完成细胞悬液封好瓶口，查对病人姓名、性别、年纪、住院号、细胞数、无菌结果、病区及诊疗项目，确定无误后，贴上标签，送病区进行回输。
细胞冻存和复苏标准操作步骤
一、溶液配置
1、程序降温盒准备：
按程序降温盒上标示量加入250ml异丙醇作为冷冻液，室温放置。
2、冻存液配置：
热灭活自体血浆加入10%DMSO。
9、细胞冻存
1、将要冻存细胞离心1200rpm，7min，去除旧培养液。
2、轻轻混匀细胞沉淀，加入适量配制好冻存培养液，DC细胞调整细胞密度为5×106/ml～2×107/ml，每管冻存0.5ml；PBMC调整细胞密度为1×107/ml～2×108/ml，每管冻存1-2ml。
3、将细胞分装入冻存管中，在冻存管上标明细胞名称，病人名称，病人编号，冻存时间。
4、将冻存管放入室温状态程序降温盒，直接置入-80℃冰箱。
5、程序降温盒内异丙醇需要定时添加，预防蒸发造成冷冻液不足。
10、细胞复苏
1、在离心管内先准备好冻存液体积10倍以上清洗液（DC用生理盐水、PBMC用培养基）。
2、水浴锅内水温达成37度。
3、将冻存管放入水浴锅内，不停晃动，直到全部融化为止，通常要求在1分钟内融化完成。
4、将细胞立即转移到清洗液中，1200转离心7分钟，去除上清，得到复苏后细胞。
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