2.硫代硫酸钠滴定液<0.1mol/L）标定取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15g，精密称定，置碘量瓶中，加水50ml使溶解，加碘化钾2g，轻轻振摇使溶解，加稀硫酸40ml，摇匀，密塞，暗处放置10分钟，用水250ml稀释，用本液滴定至近终点时，加淀粉指示液3ml，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定结果用空白实验校正。
每1ml的硫代硫酸钠滴定液<0.1mol/L）相当于4.903mg的重铬酸钾，根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量算出本液的浓度，即得。
实验四复方磺胺甲噁唑片的含量测定
实验学时：
6学时
实验类型：
验证性实验
教案方式：
集中授课，分小组实验
一、实验目的
1.掌握双波长分光光度法的基本原理。
2.掌握利用双波长分光光度法测定药物含量的操作方法。
二、实验原理
双波长分光光度法<又称等吸光度双波长消去法）：
是在两个不同波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度，以两波长处吸光度的差值<ΔA）作为定量依据来测定药物含量的方法。
双波长的选定原则：
一般选择待测组分的最大吸收波长作为测定波长<λ2），选择参比波长<λ1）使干扰组分在λ2和λ1处具有相等吸光度，从而采用ΔA计算消除干扰组分的影响。
其示意图如下：
假设样品在λ2和λ1处的吸光度分别为A2和A1，测定组分<以X表示）在λ2和λ1处的吸光度分别为
和
；干扰组分<以Y表示）在λ2和λ1处的吸光度分别为
和
：
在相同测定条件下，ΔE为一常数，因此ΔA和浓度C有线性关系，因此可以用对照品比较法测定药物的含量。
三、实验方法
供试品溶液的制备：
取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量<约相当于磺胺甲噁唑50mg与甲氧苄啶10mg），置100ml量瓶中，加乙醇适量，振摇15分钟使磺胺甲噁唑与甲氧苄啶溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液A：
精密称取干燥至恒重的磺胺甲噁唑50mg，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液A。
对照品溶液B：
精密称取干燥至恒重的甲氧苄啶10mg，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液B。
磺胺甲噁唑的含量测定：
1供试品及对照品A、B测定液的配制：
精密量取供试品溶液和对照品溶液A、B各2ml，分别置于100ml量瓶中，加0.4%NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。
同时配制空白参比溶液。
2磺胺甲噁唑含量测定参比波长的确定（磺胺甲噁唑的含量测定波长为257nm>：
1）基线描扫：
设置描扫参数，描扫波长范围200~320nm；描扫波长间隔0.2nm；对空白参比溶液进行基线描扫，扣除溶剂系统的光吸收。
2）对照品B（甲氧苄啶>测定液描扫：
以上述设置的描扫参数对照品B测定液进行光吸收描扫，得到描扫曲线与各设定波长处的光吸收强度，在波长304nm附近找出与A257光吸收强度相同<相差小于5‰）的测定参比波长，即ΔA＝A测定－A参比＝0。
3测定供试品、对照品A测定液在测定波长与参比波长处的光吸收强度：
以上述设置的描扫参数对测定供试品、对照品A测定液进行描扫，得到两者在测定波长与参比波长处的光吸收强度。
甲氧苄啶的含量测定：
1供试品及对照品A、B测定液的配制：
精密量取供试品溶液和对照品溶液A、B各5ml，分别置于100ml量瓶中，加HCl-KCl溶液稀释至刻度，摇匀。
同时配制空白参比溶液。
2甲氧苄啶含量测定参比波长的确定（甲氧苄啶的含量测定波长为239nm>：
1）基线描扫：
设置描扫参数，描扫波长范围200~320nm；描扫波长间隔0.2nm；对空白参比溶液进行基线描扫，扣除溶剂系统的光吸收。
2）对照品A（磺胺甲噁唑>测定液描扫：
以上述设置的描扫参数对照品B测定液进行光吸收描扫，得到描扫曲线与各设定波长处的光吸收强度，在波长295nm附近找出与A239光吸收强度相同<相差小于5‰）的测定参比波长，即ΔA＝A测定－A参比＝0。
3测定供试品、对照品B测定液在测定波长与参比波长处的光吸收强度：
以上述设置的描扫参数对测定供试品、对照品B测定液进行描扫，得到两者在测定波长与参比波长处的光吸收强度。
四、计算
采用测定ΔA值并利用对照品对照法来进行含量计算：
；因为对照品和供试品配置的体积相等，所以
；
每片测定的药物含量为：
五、实验结果与讨论
1测定原始数据；
2磺胺甲噁唑标示量百分数的计算；
3甲氧苄啶标示量百分数的计算；
4对测定结果的讨论与分析；
附上在测定磺胺甲噁唑和甲氧苄啶时的紫外吸收曲线图。
附注：
HCl-KCl溶液：
13.0ml0.2mol/LHCl与25.0ml0.2mol/LKCl混合均匀后，加水稀释至100ml。
实验五高效液相色谱法测定天麻的天麻素含量
实验学时：
6学时
实验类型：
设计性实验
教案方式：
集中授课，分小组设计实验
一、实验目的
1.了解高效液相色谱仪的基本结构、工作原理和操作方法。
2.熟悉样品制备对高效液相色谱法测定物质含量的影响。
3.掌握高效液相色谱测定天麻素含量的定量方法<内标法）。
二、实验原理
高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱。
当试样随着流动相进入色谱柱中后，因为样品中的不同组分在色谱柱中的流动相和固定相间的分配系数不同，各组分在两相间经过反复多次的分配<吸附－脱附－放出），经过一定的柱长后，便彼此分离，先后从色谱柱上洗脱下来，离开色谱柱进入检测器，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。
在确定的色谱条件下，特定物质成分在色谱柱上有固定的保留时间，即特定的出峰时间，并且在一定浓度范围内，特定物质成分的含量与其色谱峰面积成正比，通过测定特定物质成分与其标准品的色谱峰面积，便可计算出试样中特定物质成分的绝对含量。
高效液相色谱法因为简便、准确、重现性好，在药典中广泛应用于药物含量测定。
本实验通过设计不同的天麻素提取方法，获得天麻药材天麻素含量测定的样品，再用药典采用的HPLC法测定各样品的天麻素含量，考察样品制备方法对天麻药材中天麻素含测定的影响。
三、学生设计实验方案的要点与要求
实验设计不同提取溶剂与超声提取方法制备测试样品，考察溶剂与超声方法对天麻药材中天麻素含量测定的影响。
实验过程中将学生分为不同的组别，每组采用不同的天麻素提取方法制备测定样品，再用中国药典的HPLC法（内标法>进行麻素含量测定。
使学生明确样品制备方法与条件对HPLC法测定药材或药物中特定成分含量的影响，引导学生通过优化条件达到更好的测定效果，培养学生的科学思维能力与探索精神。
四、实验方法
1.对照品溶液的制备：
将天麻素标准品在真空干燥箱中80℃干燥1h，精密称取天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含50μg的溶液，即得。
2.供试品溶液的制备：
设计1：
采用稀乙醇作为提取溶剂制备供试品溶液（药典方法>：
见附件。
设计2：
采用60%甲醇作为提取溶剂制备供试品溶液：
制备方法同药典方法，仅提取溶剂不同。
设计3：
取本品粉末（过三号筛，50目>约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml密封，在70℃温度条件下，分别用400w的功率超声提取30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干，添加乙腈—水（3:
97>混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中。
用乙腈—水（3:
97>混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
设计4：
取本品粉末（过三号筛，50目>约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%的甲醇25ml密封，在70℃温度条件下，分别用400w的功率超声提取30min，放冷，再称定重量，用60%的甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干，添加乙腈—水（3:
97>混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中。
用乙腈—水（3:
97>混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.天麻样品天麻素含量的测定：
2018年药典方法（内标法>：
见附件。
五、实验结果与讨论
1列出测定数据，计算本小组供试药材天麻素的含量；
2附上其它设计组的供试药材天麻素含量测定结果，进行比较分析；
3附本小组天麻素含量测定的HPLC图谱；
六、思考题
1）简述高效液相色谱使用的注意事项。
2）影响高效液相色谱法对药材中特定成分含量测定的主要因素有哪些？
附件：
2018版中国药典天麻素含量测定方法：
【含量测定】照《高效液相色谱法检验标准操作程序》测定。
色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—0.05％磷酸溶液（3：
97>为流动相；检测波长为220nm。
理论板数按天麻素峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备：
取天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含50μg天麻素的溶液，即得。
供试品溶液的制备：
取本品粉末（过三号筛,50目>约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50m1，称定重量，加热回流3小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干，渣加乙腈—水（3:
97>混合溶液溶解，转移至25ml容量瓶中。
用乙腈—水（3:
97>混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：
分别精密吸取对照品溶液l0μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含天麻素（C13H18O7>不得少于0.20％。
稀乙醇：
无水乙醇529ml加到1000毫升水中即得。
20℃时浓度49.5-50.5%。
申明：
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