DNA的溶解度问题.docx

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DNA的溶解度问题

乙醇沉淀法是一种常用的技术集中的盐在水溶液中的核酸（DNA或RNA）准备。

Thebasicprocedureisthatsaltandethanolareaddedtotheaqueoussolution,whichforcesthenucleicacidtoprecipitateoutofsolution.其基本做法是，加入盐和乙醇水溶液，这迫使核酸沉淀出的解决方案。

Theprecipitatednucleicacidcanthenbeseparatedfromtherestofthesolutionbycentrifugation.然后可以休息的解决方案，通过离心分离沉淀核酸。

Thepelletiswashedincold70%ethanolthenafterafurthercentrifugationsteptheethanolisremoved,andthenucleicacidpelletisallowedtodrybeforebeingresuspendedincleanaqueousbuffer.在寒冷的70％乙醇洗涤沉淀，然后再经过离心步骤乙醇被删除，并允许核酸颗粒干燥，然后在干净的缓冲溶液中悬浮。

Sohowdoesthiswork?

那么如何工作的呢？

Abitaboutsolubility…关于溶解度的位...

Firstweneedtoknowwhynucleicacidsaresolubleinwater.首先，我们需要知道为什么核酸是易溶于水。

Waterisapolarmolecule–ithasapartialnegativechargeneartheoxygenatomduetheunsharedpairsofelectrons,andpartialpositivechargesnearthehydrogenatoms（seethediagramontheright）.水是极性分子-它有一个部分负电荷的氧原子附近，由于共用电子对，部分正电荷的氢原子（见右图）附近。

Becauseofthesecharges,polarmolecules,likeDNAorRNA,caninteractelectrostaticallywiththewatermolecules,allowingthemtoeasilydissolveinwater.极性分子，如DNA或RNA，因为这些费用，可以与水分子的静电相互作用，使他们能够很容易溶解于水。

Polarmoleculescanthereforebedescribedashydrophilicandnon-polarmolecules,whichcan'teasilyinteractwithwatermolecules,arehydrophobic.极性分子，因此可以被描述为亲水性和非极性分子，不能轻易与水分子相互作用，疏水。

Nucleicacidsarehydrophilicduetothenegativelychargedphosphate（PO3-）groupsalongthesugarphosphatebackbone.核酸是亲水性由于带负电荷的磷（PO3-）组沿糖磷酸骨架。

Theroleofthesalt…盐的作用...

Ok,sobacktotheprotocol.好吧，这样的协议。

Theroleofthesaltintheprotocolistoneutralizethechargesonthesugarphosphatebackbone.盐在协议中的作用是消除糖磷酸骨架上的收费。

Acommonlyusedsaltissodiumacetate.一种常用的盐是醋酸钠。

Insolution,sodiumacetatebreaksupintoNa+and[CH3COO]-.在溶液中，分解成Na+和[醋酸-醋酸钠。

ThepositivelychargedsodiumionsneutralizethenegativechargeonthePO3-groupsonthenucleicacids,makingthemoleculefarlesshydrophilic,andthereforemuchlesssolubleinwater.带正电的钠离子中和负电荷的核酸PO3组，分子远低于亲水性，因此多不溶于水。

Theroleoftheethanol…乙醇的作用...

TheelectrostaticattractionbetweentheNa+ionsinsolutionandthePO3-ionsaredictatedbyCoulomb'sLaw,whichisaffectedbythedielectricconstantofthesolution.钠离子在溶液中和PO3-离子之间的静电吸引力，库仑定律，这是解决方案的电介质常数的影响决定。

Waterhasahighdielectricconstant,whichmakesitfairlydifficultfortheNa+andPO3-tocometogether.水具有较高的介电常数，这使得它相当困难Na+和PO3-走到一起。

Ethanolontheotherhandhasamuchlowerdielectricconstant,makingitmucheasierforNa+tointeractwiththePO3-,shieldit'schargeandmakethenucleicacidlesshydrophilic,causingittodropoutofsolution.另一方面乙醇低得多的介电常数，使得它的Na+更容易互动，PO3-，它的电荷屏蔽，使核酸的亲水性，使其下降了解决方案。

Theroleoftemperature…温度的作用...

Incubationofthenucleicacid/salt/ethanolmixtureatlowtemperatures（eg-20or-80C）iscommonlycitedinprotocolsasnecessaryinprotocols.作为必要的协议，在协议中普遍提及的核酸/盐/乙醇的混合物在低温（如-20或-80C）的孵化。

However,accordingtoManiatisetal（MolecularCloning,ALaboratoryManual2ndEdition…2ndedition?

?

–Ineedtogetanewerversion!

）,thisisnotrequired,asnucleicacidsatconcentrationsaslowas20ng/mLwillprecipitateat0-4Csoincubationfor15-30minutesoniceissufficient.然而，根据，曼尼阿蒂斯等（分子克隆实验手册第二版...第二版-？

！

我需要得到一个新的版本），这是不是必需的，因为20ng/mL低浓度核酸沉淀在0-4C，所以在冰上潜伏期为15-30分钟就足够了。

Thewashstepwith70%ethanol…用70％乙醇洗涤步骤...

ThisstepistowashanyresidualsaltawayfromthepelletedDNA.这一步是洗任何剩余的盐颗粒的DNA。

Afewtipsonnucleicacidprecipitation…核酸沉淀的一些技巧...

▪Choiceofsalt盐的选择

▪UseSodiumacetate（0.3Mfinalconc,pH5.2）forroutineDNAprecipitations使用常规的DNA沉淀醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2）

▪UseSodiumchloride（0,2Mfinalconc）forDNAsamplescontainingSDSsinceNaClkeepsSDSsolublein70%ethanolsoitwon'tprecipitatewiththeDNA.使用DNA含有SDS自氯化钠保持SDS在70％乙醇中易溶，所以它不会沉淀的DNA样本，氯化钠（0,2米决赛浓度）。

▪UseLithiumChloride（0.8Mfinalconc）forRNA.使用氯化锂（0.8M终浓度）的RNA。

Thisisbecause2.5-3volumesofethanolshouldbeusedforRNAprecipitationandLiClismoresolubleinethanolthanNaAcsowillnotprecipitate,butbeware–chlorideionswillinhibitproteinsynthesisandDNApolymerasesoLiClisnogoodforRNAprepsforinvitrotranslationorreversetranscription.这是因为2.5-3乙醇卷应该被用于RNA沉淀和LiCl是比乙酸钠溶于乙醇，所以不会沉淀，但要小心-氯离子会抑制蛋白质的合成和DNA聚合酶，使氯化锂的RNAPREPS没有好的在体外翻译或反转录。

Inthesecases,useNaAc.在这种情况下，使用醋酸钠。

▪UseAmmoniumacetate（2Mfinalconc）fortheremovalofdNTPs,butdonotuseforpreparationofDNAforT4polynucleotidekinasereactionsasammoniumionsinhibittheenzyme.用于去除dNTPs浓度的醋酸铵（2M终浓度），但不使用T4聚核苷酸激酶反应制备的DNA铵离子抑制酶。

▪Toincreasetheyieldinprecipitationsoflowconcentrationorsmallnucleicacidpieces（lessthan100nucleotides）在低浓度或小核酸件（少于100个核苷酸）的降水以增加产量

▪AddMgCl2toafinalconcentrationof0.01M氯化镁的终浓度为0.01M

▪Increasethetimeofincubationicebeforecentrifugationto1hour.潜伏期冰离心前的时间增加至1小时。

Phenol/ChloroformExtraction酚/氯仿抽提

andEthanolPrecipitation和乙醇沉淀

DESCRIPTION描述

Phenol/ChloroformExtraction酚/氯仿抽提

OneofthemostcommonlyusedandusefulmethodsforisolationandconcentrationofDNAandRNAfromaqueoussolutionsisphenol/chloroformextractionfollowedbyethanolprecipitation.最常用的和有益的，从水溶液中的DNA和RNA的分离和浓度的方法之一是酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。

Duringorganicextraction,proteincontaminantsaredenaturedandpartitioneitherwiththeorganicphaseorattheinterfacebetweenorganicandaqueousphases,whilenucleicacidsremainintheaqueousphase.在有机萃取，蛋白质污染物变性和分区与有机相或有机相和水相之间的界面，而留在水相中的核酸。

Phenolusedinthisprotocolisbufferedtopreventoxidizedproductsinthephenolfromdamagingthenucleicacids.在这个协议中使用的苯酚缓冲，以防止破坏核酸在苯酚氧化的产品。

Beawarethatphenolcancauseseverechemicalburnsonskinandwilldamageclothing.要知道，酚可引起严重的化学烧伤，皮肤上，会损伤衣物。

Weargloves,safetyglasses,andalaboratorycoatwhenworkingwithphenol.与苯酚工作时戴手套，安全眼镜，实验室大衣。

Inthemethodpresentedhere,phenol/chloroform（50%/50%;v/v）isrecommendedforextraction.建议在这里提出的方法，酚/氯仿（50％/50％V/V）提取。

Inmostcases,thismixtureprovide在大多数情况下，这种混合物提供goodproteindenaturationandatighterinterphasebetweentheaqueousandorganicphases.良好的蛋白质变性和水相和有机相之间的更紧密相间。

Ifthereisaproblemwithexcessivefoamingduringtheextraction,isoamylalcoholcanbeaddedtoobtainanorganiccompositionofphenol/chloroform（50%/49%）/isoamylalcohol（I%）.提取过程中过多的泡沫如果有一个问题，异戊醇可以增加获得的酚/氯仿（50％/49％）/异戊醇（％）的有机组成。

ConventionalEthanolPrecipitation传统的乙醇沉淀

Duringtheethanolprecipitation,saltsandothersolutessuchasresidualphenolandchloroformremaininsolutionwhilenucleicacidsformawhiteprecipitatethatcan,easilybecollectedbycentrifugation.在乙醇沉淀，盐和其他溶质，如残余苯酚和氯仿溶液中保持，而核酸形成白色沉淀物，可以很容易地通过离心收集。

Iftheaqueousvolumeislessthan450pL,thereactioncanbeperformedinamicrocentrifugetube.如果水的体积小于450PL，反应可在离心管中。

Thisisthemostconvenientformatforperformingorganicextractionsandethanolprecipitations.这是最方便的格式进行有机提取物和乙醇沉淀。

Forlargervolumes,multiplemicrocentrifugetubescanbeused,orthereactioncanbescaledup.对于体积较大，可以使用多种离心管，可以扩展或反应。

Whenscalingthereactionup,usetightlycappedpolypropylenetubesforthephenol/chloroformextraction,andcentrifugeat2500rpmatroomtemperaturetoresolvephases.Polystyrenetubescannotwithstandthephenol/chloroform.Ethanolprecipitationcanbeperformedin15-or30-mLCorextubes,andtheprecipitatecollectedbycentrifugationat10,000xgfor15minat4OC.当缩放的反应了，使用的酚/氯仿提取，并离心机盖紧聚丙烯管在2500在室温下转速来解决阶段聚苯乙烯管能不能承受的酚/氯仿乙醇沉淀可以将在15个执行-。

。

或30-毫升的Corex管，沉淀15分钟，在4℃离心收集10,000XG。

ItisrecommendedthatCorextubesbeacidwashedbeforeusebyimmersionin50%nitricacidfor1hr,followedbythoroughrinsingindistilledwater,andautoclavingfor20min.据建议，Corex公司管是使用在50％硝酸浸泡在蒸馏水彻底清洗，高压灭菌20分钟，1小时前洗酸。

Inourhands,nucleicacidfragmentsandoligonucleotideslongerthan15nucleotidescanbeefficientlyprecipitatedusingthisprotocol.在我们的手，核酸片段和寡核苷酸超过15个核苷酸可以有效地沉淀，使用此协议。

Forefficientprecipitation,thenucleicacidconcentrationshouldbeatleast10gg/mL.为了有效降水，核酸浓度应该是至少10GG/毫升。

Lowerconcentrationsofnucleicacidscanbeprecipitated,buttherecoverymaynotbequantitative.可以沉淀核酸的浓度较低，但经济复苏可能不定量。

Toprecipitatelowernucleicacidconcentrations,incubatetheprecipitateat-20'C（orondryice）for4hrtoovernight,andcentrifugefor30mintocollecttheprecipitate.沉淀核酸浓度较低，在-20“C”（或干冰）孵育4小时至过夜，离心30分钟，收集沉淀的沉淀。

Alternatively,nanogramquantitiesofnucleicacidcanbeefficientlyprecipitatedbyaddingyeasttRNAcarriertothesolutiontoobtainanucleicacidconcentrationof10@g/mLbeforeinitiatingtheextractionandprecipitationprocedure.另外，可以有效地沉淀核酸纳克数量加入酵母tRNA载波解决方案前发起的提取和降水过程，获得了10克/毫升的核酸浓度。

ThepresenceofTRNAcarrieristypicallynotaproblem,exceptwhenthecarrierwillinterferewithsubsequentenzymaticmanipulationsofthesample（eg,ifaDNAfragmentwillbeend-labeledwithT4polynucleotidekinase）.tRNA的载体的存在通常是没有问题的，除承运人时，会干扰随后的酶样品的操作（例如，如果将DNA片段，用T4多核苷酸激酶末端标记）。

Therecommendedsaltformostroutineapplicationsofthismethodis0.3Msodiumacetate（finalconcentration）,whichismoresolubleinethanolthan0.3Msodiumchlorideandthereforelesslikelytoprecipitatewiththenucleicacidsample.这种方法最常规应用的建议盐0.3M醋酸钠（终浓度），这是更大于0.3m氯化钠溶于乙醇，因此不太可能与核酸样品沉淀。

Forsamplescontainingsodiumdodecylsulfate（SDS）,therecommendedsaltis0.2Msodiumchloride,sincetheSDSissolubleinethanolundertheseconditions.对于含有十二烷基硫酸钠（SDS）的样品，建议的盐是氯化钠0.2mol以来，SDS是在这些条件下易溶于乙醇。

Forremovaloftriphosphates（labeledorotherwise）,2Mammoniumacetateisrecommendedinsteadof0.3Msodiumacetate,sincetriphosphatesarelesslikelytoprecipitateundertheseconditions.2M醋酸铵为三磷酸去除（或其他标记），而不是建议的0.3M醋酸钠，因为三磷酸沉淀在这些情况下是不太可能的。

Ammoniumacetateisnotrecommendedifthenucleicacidsamplewillbe5'phosphorylated