实验方案Word格式.docx

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观察动物的一般情况,包括毛色、活动度、进食量、体重等,并记录动物在接种肿瘤后的死亡时间。

以对照组20%动物存活时间不得超过4周为依据,故设第29天终止实验,并计算小鼠生命延长率。

抑瘤作用是西黄丸的主要药理作用，实验显示1.08、2.16g/kg剂量下西黄丸对H22荷瘤小鼠及EAC荷瘤小鼠的生存状态明显好于环磷酰胺组（0.02g/kg），同时，西黄丸在2.16g/kg剂量下，可明显延长荷瘤小鼠的生存时间，生命延长率可达30%以上。

[4]徐浩,崔立然,刘吉成.西黄丸对H_（22）荷瘤小鼠Bcl-2基因mRNA表达的影响[J].现代预防医学,2011,11:

2120-2121.

本实验采用RT-PCR法测定H22荷瘤小鼠瘤组织中bcl-2基因mRNA在给药前后的表达差异，为传统中成药西黄丸临床上治疗肿瘤提供更科学的理论依据。

进一步研究发现西黄丸可下调H22荷瘤小鼠瘤组织中凋亡相关基因bcl-2基因mRNA的表达。

1.2动物

选用清洁级昆明种（KM）小鼠，体重（20±

2）g，6～8周龄，雌雄各半，黑龙江中医药大学药物安全评价中心（GLP）提供合格证号：

01-10-2。

1.3瘤株

H22瘤株由齐齐哈尔医学院药物研究所提供。

1.4主要仪器及试剂

离心机（Microfuge18Centrifuge，BECKMANCOULTER，德国）；

超净工作台（苏州净化设备厂）；

可见／紫外分光光度计（765PC型上海光谱仪器有限公司）；

电泳凝胶图象分析系统（Backman公司）；

梯度PCR仪（EPPERFOR2002型德国）；

RT-PCR试剂盒（美国Promega公司）；

PCRMarker美国Promega公司）；

bcl-2、β-actin的引物（英骏生物技术有限公司合成）。

1.5实验方法

1.5.1分组及给药超级洁净工作台上无菌取接种于d8转移癌H22腹水（活细胞计数大于95%），用0.9％氯化钠注射液稀释成2×

106／ml，取清洁级KM小鼠雌雄各半，共40只，每只鼠右侧腋部皮下接种0.2ml瘤细胞悬液。

于接种24h后随机分4组，模型组（0.9%氯化钠注射液（LHN）ig0.2ml／10g／d，ipLHN）；

XHW组（XHWig0.2ml／10g／d，ipLHN）；

CTX组（LHNig0.2ml／10g／d，ipCTX30mg／kg／d）；

联合用药组（XHW＋CTX组）（XHWig0.2ml／10g／d，ipCTX30mg／kg／d），连续给药10d，末次给药后禁食12h，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡消毒后剥离瘤组织，置于液氮中保存备用。

1.5.2RT-PCR检测荷瘤小鼠bcl-2mRNA的表达按总RNA提取试剂盒操作步骤，从100mg瘤组织中提取总RNA。

取1μlRNA样品，加入DEPC处理水稀释至50μl，混匀后加入比色杯中。

在260nm和280nm分别3次读取吸光度值，RNA

纯度以OD260／OD280的比值表示。

逆转录反应以总RNA1μg为模板，分别加入10mmol／LdNTP2.0μl、5mmol／LMgSO41.5μl、25×

buffer4.0μl、AMV（逆转录酶）1μl，加DEPCH2O至终体积为20μl并混匀。

优化后的逆转录条件为42℃1h，合成第一条cDNA链。

分别取逆转录所得1、2、3、4号cDNA模板各2.0μl，与bcl-2及β-actin的上下游引物（表1）各0.5μmol／L配制成25μl的PCR反应体系，加入到96孔板中，1、2、3、4四个样本各设置6个复孔，加入循环参数为94℃5min，然后94℃30s，58℃40s，72℃50s，共40个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量比较鉴定之后，在数字成像仪上照相、扫描分析。

[5]马杰,王一尧,杨伟,关硕,曾常茜,高文斌,梁文波.西黄丸抗肿瘤作用及其免疫清除功能的实验研究[J].中国中药杂志,2014,39（8）:

163-165.

目的:

探讨西黄丸对荷瘤大鼠的抗肿瘤作用及其对荷瘤机体免疫清除功能的影响。

方法:

采用Walker256建立大鼠荷瘤模型，随机分为空白对照组、模型对照组、香菇多糖组、西黄丸低、中、高剂量组，每组10只。

造模后连续治疗给药14d。

腹主动脉取血，取瘤，计算抑瘤率;

采用流式细胞技术（FCM）检测外周血中CD3+，CD4+，CD8+T细胞及黏附分子B7-1（CD80）的含量;

ELISA测定外周血IL-2，IFN-γ表达水平。

结果:

西黄丸高剂量组抑瘤率为33.1%;

与对照组比较，模型组大鼠外周血中IL-2，IFN-γ水平及CD3+，CD4+，B7-1含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;

与模型组比较，西黄丸高剂量组大鼠外周血中IL-2，IFN-γ水平及CD3+，CD4+，B7-1含量增高（P＜0.05）。

结论:

西黄丸可通过提高外周血IL-2，IFN-γ水平及CD3+，CD4+，B7-1含量，增强免疫清除功能，发挥其抗肿瘤作用。

[6]王志宏,王中霞,刘超,欧阳兵,李峰,王文苹,吴超,季旭明.西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响[J].山东大学学报（医学版）,2013,04:

18-20.

摘要:

目的研究西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响。

方法将H22荷瘤小鼠模型分为模型组、西黄丸组、西黄丸滴丸不同剂量组，干预10d后，测定各组小鼠的脾指数和胸腺指数，ELISA法测定小鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

结果西黄丸滴丸低、中、高剂量均对H22荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用，其抑瘤率分别为62．45%、70．61%、76．93%;

各剂量西黄丸滴丸均能提高免疫器官的质量及血清中TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

结论西黄丸滴丸具有明显的抑制肿瘤生长和增强机体免疫功能作用。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物与瘤株昆明种小白鼠，体质量18～22g，雌雄各半，山东中医药大学实验动物中心提供，SPF级实验室喂养;

腹水型小鼠肝癌H22细胞株购自山东省医学科学院药物研究所。

1．1．2实验药物与试剂西黄丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号:

Z11020073;

西黄丸滴丸（自制）;

环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股

份有限公司，批号:

100231-201203。

TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γELISA试剂盒购自上海研辉生物科技有限公司。

环磷酰胺是广泛应用的抗癌药物之一，治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、尤文瘤、软组织肉瘤.

1．2方法

1．2．1西黄丸滴丸的制备工艺条件为PEG8000∶PEG10000=1∶1作为基质，药物与基质比为1∶1．5，二甲基硅油100作为冷却剂，冷却剂温度采用梯度冷却方式（上部温度30℃，下部温度0～5℃），药液温度75℃，滴速20～25滴/min，滴距为4cm。

称取一定量的基质，75℃熔融后加入采用超临界CO2提取技术提取的乳香、没药中有效成分挥发油及超微粉碎技术制得的牛黄麝香粉末，混匀后滴制。

1．2．2移植瘤模型的建立无菌环境下，抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，生理盐水稀释，调整细胞浓度为（2～3）×

107/mL，测定细胞活力，活细胞率≥95%。

每只小鼠右腋下接种0．2mL。

1．2．3西黄丸及滴丸对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用接种24h后，将小鼠随机分为6组:

模型组，西黄丸组（2．2g/kg），滴丸低、中、高剂量组（1．5、3．0、6．0g/kg），CTX组（20mg/kg），每组10只。

西黄丸及滴丸各剂量组灌胃给药，模型组给予等容量生理盐水，每日1次;

CTX组腹腔注射，每2天1次。

给药10d。

停药次日脱颈椎处死荷瘤小鼠，剥离瘤块，称瘤质量，计算抑瘤率。

抑瘤率（%）=（对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量）/对照组平均瘤

质量×

100%。

1．2．4西黄丸及滴丸对小鼠免疫功能的影响按照上述方法制备荷瘤小鼠，分5组给药干预:

模型组，西黄丸组（2．2g/kg），滴丸低、中、高剂量组（1．5、3．0、6．0g/kg）。

西黄丸及滴丸各剂量组灌胃给药，模型组给予等容量生理盐水，每日1次，连续10d，末次给药24h后摘眼球取血，静置4h，3000r/min离心15min，取血清置于－20℃保存。

采用ELISA法按照试剂盒操作说明书测定血清TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

分离脾脏和胸腺，电子天平精确称量脾脏和胸腺的质量，计算每克体质量的脾指数和胸腺指数。

[7]唐曦,胡娅,胡国清.西黄丸与氟尿嘧啶联合应用的抗肿瘤作用[J].医药导报,2005,24（9）:

757-759.

[摘要]目的研究西黄丸与氟尿嘧啶（5Fu）联合应用对小鼠移植性肿瘤S180肉瘤生长的抑制作用。

方法小鼠S180细胞接种于昆明种小鼠右前肢腋窝皮下,建立S180实体瘤模型小鼠60只,随机分为4组:

阴性对照组（灌胃并腹腔注射0.9%氯化钠注射液）、西黄丸组（2.0g/kg􀀁

1,ig）、5Fu组（0.02g/kg1,ip）、联合用药组（西黄丸,2.0g/kg1,ig;

5Fu,0.02g/kg1,ip）。

小鼠接种后开始给药,每天1次,连续7d。

观察各组小鼠移植瘤生长情况及体重变化。

停药后第2天处死小鼠,称瘤重,计算瘤重抑制百分率。

结果西黄丸组抑瘤率28.1%,5Fu组抑瘤率35.3%,联合用药组抑瘤率55.4%,与阴性对照组比较,差异均有显著性（P<

0.05）;

联合用药组抑瘤率高于单用西黄丸或5Fu组（均P<

0.05）。

结论西黄丸和5Fu联合应用对小鼠移植性肿瘤S180有明显抑制作用,两者有协同作用。

1􀀁

材料与方法􀀁

1.1􀀁

材料􀀁

动物:

昆明种小白鼠,雌性,体重18~22g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

试剂:

西黄丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,批号:

3030472）,5Fu（天津金耀氨基酸有限公司,批号:

0403312）。

移植性肿瘤:

肉瘤S180,华中科技大学同济医学院药学院肿瘤研究室提供,昆明种小鼠腹腔传代。

1.2􀀁

方法

1.2.1􀀁

小鼠荷S180肉瘤模型的建立选择接种后10d、一般状况较好的瘤种动物,仰卧固定,消毒皮肤,抽取腹腔积液,以0.9%氯化钠注射液稀释,计数,调整细胞浓度至2.0107mL1,于小鼠右前肢腋窝皮下接种S180细胞悬液0.2mL。

1.2.2􀀁

实验动物分组与给药方法􀀁

昆明种雌性小鼠60只,称重后随机分为4组,每组15只。

从接种次日开始给药,3个药物组分别按以下3种方式给药,西黄丸组:

按2.0g/kg1剂量灌胃给药;

5Fu组:

按0.02g/kg1剂量腹腔注射给药;

联合用药组:

灌服西黄丸2.0g/kg1,同时腹腔注射5Fu0.02g/kg

1。

阴性对照组每天灌服并腹腔注射等体积的无菌0.9%氯化钠注射液。

每天给药1次,连续7d,每天记录体重,停药后第2天将各组动物称重并断髓处死,钝性剥离瘤组织,电子天平称重。

1.2.3􀀁

检测指标动物体重、瘤重,计算肿瘤抑制率。

瘤重抑制率（%）=（阴性对照组平均瘤重-药物组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重100%

1.2.4药效评价􀀁

阴性对照组小鼠肿瘤平均重量<

1g或>

20%小鼠瘤重<

400mg表示肿瘤生长不良。

在治疗期间给药组小鼠死亡>

20%,或平均体重（去

瘤后）下降>

15%,表明该药物有毒性反应。

如所试药品肿瘤抑制率>

30%,并经统计学处理差异有显著性时,认为有效[5]。

5Fu是临床常用的抗肿瘤药,对多种消化系及头颈部肿瘤等有较好的治疗作用,但其毒性反应较大,其常见的不良反应有消化道反应、骨髓抑制、肝功能损害

等。

[8]王玉荣,曾繁涛,罗意文.西黄丸对细胞突变与肿瘤生长抑制的研究[J].宜春学院学报,2008,30（4）:

99-100.

目的:

探讨西黄丸的抗突变和抗肿瘤作用。

以小鼠骨髓细胞微核试验和睾丸染色体畸变实验观察西黄丸的抗突变作用;

以S-180和H-22移植性肿瘤观察西黄丸的抗肿瘤作用。

西黄丸对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核和丝裂霉素诱发的小鼠睾丸细胞染色体畸变均有明显的抑制效果;

对S-180和H-22小鼠移植性肿瘤生长有明显的抑制作用。

西黄丸对体细胞和生殖细胞的DNA损伤均有较好的保护作用;

对小鼠移植性肿瘤较好的抑瘤作用。

本研究以小鼠骨髓细胞微核率和小鼠睾丸染色体畸变率及对S-180和H-22小鼠移植性肿瘤的瘤重变化为观察指标,对西黄丸的抗突变和抑制肿瘤细胞生长的作用进行研究,以期为与其他抗癌药物的药效学作比较奠定基础。

1.1􀀁

实验材料:

西黄丸（通化金马药业股份有限公司,批号:

20070821）。

试验动物为昆明种小鼠,由广东省医学实验动物中心提供,合格证号:

2006A018;

S-180和H-22瘤细胞株均购自中国医学科学院药物研究所。

1.2􀀁

实验方法

1.2.1􀀁

小鼠骨髓细胞微核试验健康昆明种雄性小鼠40只,体重为20~22g,随机分为4组,阳性对照组和西黄丸高、中、低3个剂量组,每组10只。

西黄丸高、中、低剂量分别为0.4g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg,经口灌胃,连续21d,对照组同时以蒸馏水灌胃。

试验末期（最后2d）,西黄丸各组及阳性对照组经口给予致突变物环磷酰胺（40mg/kg体重）2次（中间间隔24h）。

第2次给予环磷酰胺后6h颈椎脱臼法处死小鼠,取股骨骨髓常规制片,每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞,计数微核率,以表示。

结果采用泊松分布统计法处理。

1.2.2小鼠睾丸染色体畸变试验[1]健康雄性小鼠40只,体重为20~22g,分组和受试物剂量均同小鼠骨髓细胞微核试验,经口灌胃,连续21d,第14d西黄丸各组及阳性对照组经口给予丝裂霉素（2􀀁

0mg/kg􀀁

体重）1次,西黄丸各组继续给予受试物7d后处死动物,处死动物前6h腹腔注射秋水仙素（4.0mg/kg）,取动物双侧睾丸,去被膜,分离曲细精管,用0.1%的柠檬酸钠低渗,甲醇和冰醋酸（3:

1）固定,制片,Gimese染色,油镜镜检各组分散良好的初级

精母细胞畸变率,结果采用泊松分布统计法处理。

1.2.3􀀁

西黄丸对S-180小鼠抑瘤试验雄性昆明种小鼠,体重20~22g。

实验动物随机分为阳性对照组和西黄丸高、中、低3个剂量组,每组10只动

物,西黄丸高、中、低剂量分别为0.4g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg,经口灌胃,阳性对照组同时以蒸馏水经口灌胃。

连续14d。

第15d,在无菌条件下,于右侧腋窝皮下接种S-180肿瘤细胞悬液5×

106细胞0.2m,l接种后,各组继续按前法灌胃,7d后,颈椎脱臼处死小鼠,取出瘤体称重,结果采用单因素方差分析统计处理。

1.2.4􀀁

西黄丸对H-22小鼠抑瘤试验雄性昆明小鼠,体重20~22g,动物分组和剂量同西黄丸对S-180小鼠抑瘤试验。

经口灌胃,第15d在无菌的条件下,于右侧腋窝皮下接种H-22肿瘤细胞5×

106细胞0.2m,l接种后各组继续前法灌胃,7d后,颈椎脱臼处死小鼠,取出瘤体称重,结果采用单因素方差分析统计处理。

中药抗肿瘤作用的有效成分,可能是通过直接抑制肿瘤细胞的增殖[2]、抑制多种促肿瘤细胞生长激素和细胞因子释放[3]、抑制肿瘤血管生成[4]和诱导肿瘤细胞调亡[5],从而达到抗肿瘤作用,其确切机制有待进一步研究。

[9]李晓丽,宋振华.加味保安方对带瘤C57小鼠肿瘤及肺组织VEGF表达水平的影响[J].江西中医学院学报,2007,19（4）:

70-71.

探讨加味保安方对Lweis肺癌C57小鼠肿瘤和肺组织的VEGF表达水平的影响。

将Lweis肺癌C57小鼠分为加味保安方大、小剂量组,西黄丸对照组,模型组,观察各组对Lweis肺癌C57小鼠对肿瘤和肺组织的VEGF水平的表达。

加味保安方大、小剂量及西黄丸均抑制Lweis肺癌C57小鼠肿瘤及肺组织的VEGF水平的表达（P<

0.05）,尤其是加味保安方大剂量作用明显,与西黄丸相当。

加味保安方能明显降低Lweis肺癌C57小鼠肿瘤及肺组织的VEGF水平的表达。

探讨本方抗肿瘤转移的机制,对带瘤C57小鼠瘤组织及肺组织VEGF表达水平的进行了实验研究,报道如下。

1实验材料

1.1实验药物加味保安方:

生大黄、干姜、炮附子、醋制鳖甲、冬凌草。

西黄丸:

牛黄,乳香（醋制）,没药（醋制）,麝香。

吉林金泉药业股份有限公司生产。

产品批号20030401。

1.2实验仪器、试剂RNA提取试剂盒:

MBI公司。

RT试剂盒:

Introgen公司。

PCR试剂盒:

上海生物工程有限责任公司。

引物合成:

其他试剂:

DEPC,EB,琼脂糖,异丙醇,三氯甲烷,醋酸钠,硼酸,异硫氰酸胍,SPS等均购自上海生物工程有限责任公司。

1.3实验动物SPF级雌性C57BL/6小鼠40只,体重18~20g,购于中国科学院上海实验动物中心。

合格证号:

SCXK（沪）2002-0010。

Lewis肺癌带瘤小鼠:

购于北京医科院药物所。

2实验方法

2.1瘤细胞悬液制备将Lewis肺癌带瘤小鼠放入超净台内,固定于蜡版上,剖开皮肤,无菌取瘤组织,去掉包膜和坏死组织,选取周围生长旺盛的瘤组织,制成细胞悬液,调整成细胞浓度为2@108的肿瘤混悬液,待用。

2.2分组及肿瘤移植将未带瘤C57小鼠称重,随机分为4组,每组10只,加味保安方大剂量组、加味保安方小剂量组、西黄丸组及模型组,均在右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2ml/只。

2.3给药加味保安方按成人体表面积折算小鼠加味保安方大、小剂量为14.04、7.02g/kg;

西黄丸组剂量为0.78g/kg。

根据临床应用方法西黄丸组口服灌胃,模型对照组灌服等剂量的生理盐水。

自种瘤第2天起灌胃给药,连续给药16d,期间小剂量组因灌胃不当死亡1只。

2.4取肿瘤组织及肺组织给药第16天,处死小鼠,放入超净台内,固定于蜡版上。

剖开皮肤取瘤,取带瘤各组肿瘤组织及各组肺组织,置于冷冻管中,-70e保存,备用。

2.5检测方法及步骤

2.5.1引物设计参照有关文献合成引物[4],由上海生物工程公司合成。

B-actin:

上游引物:

5.GGACTTGATTCCTTCATTCAGTC3.,下游引物:

5.CTCCTCCTACTATAAGCTAAGA3.,扩增后DNA片段长度为569bp;

VEGF-C:

5.CGCTTAGGBACGATTAGAGTAACC3.,下游引物:

5.TACGTCAGTATCGCCGCAAATTTC3.,扩增后DNA片段长度为497bp。

2.5.2mRNA提取所有操作器械均经DEPC处理或高温去Rnase处理。

取保存的肿瘤组织及肺组织,用GIT变性液冰浴研磨,充分破碎,加2M醋酸钠（1/10体积）,充分