BD流式细胞仪.docx

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BD流式细胞仪

简介流式细胞仪……………………………………………………3

流式细胞仪的临床检验项目

淋巴细胞亚群分析……………………………………………………………4

肿瘤细胞DNA检测分析………………………………………………………5

白血病及淋巴瘤免疫分型……………………………………………………6

残余白血病检测……………………………………………………………..6

网织红细胞计数……………………………………………………………..7

造血干细胞计数……………………………………………………………..7

血小板疾病及活化血小板检测……………………………………………..8

HLA-B27检测…………………………………………………………………8

器官移植的配型及免疫状态监控…………………………………………..9

AIDS诊断及治疗监控……………………………………………………….9

流式细胞仪的临床/医学研究……………………………………10

流式细胞技术的发展及国内现况……………………………….10

建议流式细胞仪之机型----BD公司FACSCalibur

仪器主要特点……………………………………………………………..11

配套设施（计算机、软件、试剂、样本制备仪、售后服务）………..12

仪器主要技术参数…………………………………………………………15

BD公司全球及中国业务介绍

BD公司流式细胞仪培训计划

BD公司推荐配置单

BD公司仪器与其他厂家仪器比较表

一、简介流式细胞仪

（一）流式细胞仪概念

流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。

简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。

（二）原理

待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。

当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。

经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。

（三）流式细胞仪检测的细胞特性

细胞结构组成

细胞功能

大小

细胞表面、胞浆、核特异性抗原

粒度

细胞活性

DNA、RNA含量

胞内细胞因子

蛋白质含量

激素结合位点

钙离子、pH值、膜电位

酶活性

二、流式细胞仪的临床检验项目

目前在国内最常见的临床应用有两大类：

一为肿瘤细胞的DNA含量析；

另一为细胞表面的表型测定，包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病和淋巴瘤免疫分型、残余白血病检测、以及HLA-B27组织抗原检测等等。

1、淋巴细胞亚群分析

淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控疾病状态下的免疫状况（如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等），以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。

检测原理：

利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。

最常检测的亚群包括T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、NK细胞（CD16+56）、辅助性T细胞（CD3+CD4+）和抑制性T细胞（CD3+CD8+）等。

应用实例：

SimulSET系统利用CD14/CD45设门技术精确检测淋巴细胞亚群比例。

*其中绿色细胞群体为淋巴细胞，红色为单核细胞，蓝色为粒细胞。

2、DNA分析

肿瘤细胞的DNA倍体分析是流式技术另一重要应用，临床上可对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。

检测原理：

正常人体细胞的DNA含量是二倍体，细胞群体具有特定的增殖比例。

通过检测细胞的DNA含量和增殖比例，可以了解细胞群体的倍体性和增殖能力。

具体操作时，先将实体组织制备成单细胞悬液，用固定或去污剂在细胞膜上打孔，使DNA特异的荧光染料如PI（碘化丙啶）导入细胞核，PI和DNA缄基对特异结合后上机检测PI的荧光强度，并进行数据分析。

应用实例：

乳腺癌病人的手术标本分析图。

*其中红色群体为二倍体，黄色群体为异倍体。

3、白血病和淋巴瘤免疫分型

正常白细胞在其分化过程中，随着系列的不同、成熟阶段的差异，会在细胞膜表面表达不同的分化抗原。

白血病细胞则在癌变的过程中，丧失了正常细胞底系列专一性和分化阶段规律性，在本质上有别于正常骨髓细胞。

应用此特点可进行免疫表型分析，以鉴别各种白血病和淋巴瘤，辅助临床诊断、评估疗效和预后。

常用的抗原包括：

CD3、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD10、HLA-DR、

CD13、CD14、CD33、CD34、GLY-A、MPO等等。

应用实例：

利用CD45三色分析急性髓性白血病。

*左图为正常骨髓，绿色为正常淋巴细胞，深红为单核细胞，玫瑰红为成熟粒细胞，浅蓝为有核红细胞，深蓝为未成熟细胞；右图为急性髓性白血病图形，可见与正常明显的差别。

4、残余白血病检测

残余白血病是指经过适当的治疗、疾病缓解后仍残留在病人血中的极少量白

血病细胞。

通常白血病病人经过化疗后的疾病复发率为60-80%，经过自体或异体骨髓移植后的复发率仍偏高（20-50%）。

所以如果能早期检测到复发的迹象，即白血病细胞的再增生，则可以提前给予病人及时恰当的治疗。

依照不同的白血病，选用不同的抗体组合（如下表）来检测残余白血病。

流式细胞术可在一万个骨髓细胞中检测到一个白血病细胞；尤其是TdT的应用大大提高了检测灵敏度。

白血病种类

可选择的抗体组合

T-ALL

cytoCD3/TdT

B-ALL

CD13/TdT，CD33/TdT

Pre-B-ALL

cytoμ/TdT

AML

CD13/TdT，CD33/TdT，CD7/TdT

5、网织红细胞分析

网织红细胞计数是骨髓红细胞造血功能的重要指标。

传统手工计数耗时耗力，缺乏准确性。

流式细胞仪网织红细胞计数系统由于采用系统试剂与全自动软件，可在短时内分析大量细胞，低水平网织红细胞也可达到统计分析精度，省时省力，结果正确可靠。

*左图中红色群体为红细胞，右图利用RNA染料噻唑橙（TO）区分成熟红细胞和网织红细胞。

6、造血干祖细胞检测

在治疗恶性血液病时，大剂量化疗或放疗摧毁有病的骨髓后，干细胞移植保证了健康的干祖细胞重建骨髓，产生正常的血细胞，实体肿瘤病人亦可通过干细胞移植抗衡大剂量化疗导致的致死性血液毒性。

与大剂量化疗相配合的干细胞移植已在临床大大提高了某些肿瘤病人的长期存活率，如乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌等。

另外，干细胞移植与再生障碍想贫血、免疫缺隐、血红蛋白病等非恶性造血系统疾病治疗的相关性也正在研究中。

*上图中红色群体是经过多参数设门后精确设定的CD34阳性细胞群体，绿色部分是进行定量计数的标准微球。

7、血小板疾病及活化血小板检测

通过血小板膜糖蛋白的检测可以诊断先天性或获得性血小板疾病如Bernard-Soulier综合征（CD42b-42a），血小板无力症（CD41-CD61），免疫性血小板减少等等。

评价血小板活化程度的应用领域包括：

缺血性冠状动脉疾病如心绞痛、心肌梗死、血管成形术、心肺旁路术等；缺血性脑血管病如脑梗塞、TIA、脑动脉硬化等；糖尿病；恶性肿瘤；高血压病；高脂蛋白血症；高粘滞血症；抗血小板药物机制研究与疗效监测；吸烟；情绪性应急等。

应用实例：

CD61/CD62P/PAC-1三色标记分析血小板活化。

8、HLA-B27检测

由流行病学统计结果显示，HLA-B27基因型阳性的人患数个遗传性免疫疾病的机率，比一般人要高很多，以强直性脊柱炎为例，约为87倍。

因此HLA-B27检测可以有效帮助临床鉴别诊断强直性脊柱炎等血清阴性骨关节疾病。

其他相关性疾病有：

遗传性关节炎如Reiter’s综合征,反应性关节炎，肠性关节炎等。

检测时选用CD3/HLA-B27双标记抗体，圈定T淋巴细胞亚群，再分析其细胞表面是否表现HLA-B27组织抗原。

因为T细胞表面只表达ClassⅠ型HLA抗原，可避免ClassⅡ型HLA抗原引起的误差。

应用此法无需分离细胞，比传统的微量细胞毒实验节约时间，且检测结果更敏感、客观、容易判读。

9、器官移植的配型及免疫状态监控

以流式细胞仪进行器官移植前配对（FlowCytometryCrossMatch，FCCM）的优势在于抗体检测的特异性、敏感度以及检测结果和手术成功率之相关一致性。

利用多参数测定，可了解受者血中是否有抗供者抗体，此抗体与供者的哪种白细胞反应，以及该抗体是否会造成细胞毒性。

移植前的评估包括HLA配型及混合淋巴细胞反应，移植后的评估包括外周血淋巴细胞亚群测定、抗供者抗体检测等等。

移植后定期检查外周血淋巴细胞亚群，可以预估排异反应，以及病毒感染等问题。

10、AIDS诊断及治疗监控

由于特定细胞群体的绝对计数在临床诊断与治疗上具有极大意义，如CD4+细胞绝对计数可辅助HIV监控治疗，也可通过定量标准微球得到亚群的绝对数值。

应用实例：

检测艾滋病人血中辅助T细胞和抑制T细胞的比例及绝对数。

三、流式细胞仪的临床/医学研究

流式细胞仪应用的灵活性允许临床医生科学家们充分发挥想象，满足他们的临床研究需要：

细胞免疫功能、细胞凋亡、胞内细胞因子、胞内Ca2+及PH值、多药耐药性、寄生虫、细菌、病毒、环境科学等等。

流式细胞仪多参数分析配合细胞分选，可以提供样本的更多有效信息。

细胞分选是确认细胞形态、进行后续分子生物学研究（如FISH、PCR等）或细胞功能性研究的理想手段。

四、流式细胞技术应用的发展及国内现况

从1930年，Caspersson和Thorell以细胞的计数开始，试图寻找研究细胞的新工具，到1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACSI，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。

进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善，仪器的硬件平台也已达到稳定的技术状态，科学家们、仪器制造商们又纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发、单克隆抗体技术、细胞的制备方法和提高电子信号的处理能力上来，以拓展日趋广泛的应用领域。

流式细胞技术的强大生命力植根于生物学、医学的各个领域，正是无数日新月异、变化多样的应用项目在全球范围内推动了流式细胞技术的发展。

自1981年，北京师范大学生物系引进中国第一台流式细胞仪（FACSⅢ，BDIS）至今，各种型号的流式细胞仪在国内安装使用已超过300台，其中BD公司的流式细胞仪近230台（FACSCalibur已超过140台，详见附录2“BD公司国内流式细胞仪用户名单”）。

从仪器引入中国二十年的发展历史来看，最早的流式细胞仪大都应用在纯科研领域。

随着流式技术的发展，方法学的成熟，尤其是越来越多的用于临床的试剂推出，流式细胞仪已成为国内各大教学医院和医学中心重要的诊断工具，被广泛地应用于新的临床实验上。

五、建议流式细胞仪之机型----BD公司FACSCalibur：

FDA通过的世界唯一全自动四色台式分选机

FACSCalibur集分析和分选功能为一身，配置灵活，结合自动化的样本处理系统、极宽的试剂选择范围、强大的计算机和软件系统，绝对配合今天高效多能的实验室需要。

FACSCalibur性能卓越，不仅通过其用户友好的整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、DNA、网织红细胞、血小板、绝对计数等临床分析，FACSCalibur更以其完美的四色分析和独特的分选功能成为遗传、肿瘤、血液、免疫功能等诸多研究不可或缺的重要工具。

（一）、FACSCalibur仪器主要特点

∙完美的四色分析系统

BD专利的立体空间激发系统采用双激光实现4色分析，最大程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度；双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，相应地扩大了仪器的应用领域。

立体空间激发系统为流式细胞仪多色分析设立了行业标准，并使染料的选择更为自由，避免了染料之间的相互干扰。

∙独特的分选及浓缩系统

FACSCalibur是世界上目前唯一的台式分选机。

FACSCalibur采用不同于传统分选方式的“捕获管（catchtuber）”新技术，使整个分选操作极其简便，无需长时间液流稳定，只需设定感兴趣的细胞群体，鼠标轻轻一按就能实现对目标细胞的分选。

细胞可分选到试管中，或根据需要直接分选到细胞浓缩系统提供的滤膜或培养皿上。

FACSCalibur分选为全封闭系统，安全性好，可实现无菌分选和细胞培养。

细胞浓缩系统使细胞回收简单方便，减少离心步骤，大大提高细胞回收率。

∙自动化程度高

FACSCalibur以用户为中心的系统设计，从自动化样本处理、自动上样，到按钮式液流控制、自动化软件获取和分析，每个环节操作都保证简便快捷,并提供准确客观的实验结果，重复性极好。

∙分析速度快

FACSCalibur荧光检测全部采用大型流式细胞仪国际通用的光电倍增管以保证最快的分析速度10000个细胞/秒，避免了使用----导致的低速度。

FACSCalibur是目前世界上分析速度最快的台式机。

DNA分析的解决之道

DDM（Doublet　DiscriminationModule）双粘体辨别模式

通过FL2-W和FL2-A检测分析区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少假阳性，是实体组织标本DNA分析不可缺少的工具之一。

∙唯一的双参数阈值设定

最大程度减少无关噪音，增加获取分析速度，从而使含量极微的细胞检测成为可能。

∙开机无需等待

开机后即可检测样本。

机器无噪音。

设计灵活，提供多种配置供用户选择

第二根激光、分选及其浓缩系统、自动进样系统等都可以由用户根据实际需要和资金情况自由选配。

（二）、配套设施

1、FACStation数据处理系统

采用最先进的Macintoshi苹果计算机系统，用户友好MacOS界面设计，易学易操作；与PC兼容性好，数据可在PC机上分析；网络功能强大，可与Internet和Intranet连接；不易感染病毒超强图形处理功能，可进行多维多色分析，是处理流式数据最佳的选择。

最新配置MacintoshG4：

512MRAM；

80GBHardDisk；

CD-RW，容量大,为回顾性研究带来方便；

多媒体系统；

17’高分辨率纯平显示器

FACStation提供多种功能强大的自动化软件用于数据获取、分析和报告。

并提供多媒体学习光盘。

主软件CellQUEST具有完成所有流式实验的仪器设置、数据获取和统计分析等功能，设计灵活全面，是流式细胞仪系统不可缺少的全能工具。

全面配合各种临床检验的自动化软件系统包括：

FACSComp自动校准仪器设置进行质量控制，自动设置流式双色、三色、四色分析条件，并可选择进行样本设置条件的优化。

自动存储仪器条件。

SimulSET双色淋巴细胞自动化分析：

CD45/CD14自动淋巴细胞精确设门与分析；软件内一致性检测作为内在质控；可自行定义抗体组合，灵活方便；自动打印标准化实验室报告、医生报告和总结报告。

MultiSET三色与四色淋巴细胞自动化分析：

提供CD45/SSC淋巴细胞门的手动与自动设置与分析；应用Attractor技术自动检查细胞群体

位置漂移；客户可自定义试剂与抗体组合；绝对值定量简单快速准确；自动打印标准化实验室报告、医生报告和总结报告。

ProCOUNT造血干祖细胞自动化分析软件；使用ProCOUNT试剂自动获取分析造血干细胞；与TroCOUNT管组合实现绝对计数；操作简单，快速；降低CD34计数的变异；自动打印标准化实验室报告、医生报告和总结报告。

HLA-B27自动分析软件；自动获取分析报告全血HLA-B27结果：

支持HLA-B27系统试剂；应用FACSLoader组合可实现自动获取批量分析；配合FACSComp软件进行自动校正；自动打印标准化实验室报告。

ModFIT高精度DNA自动分析软件：

快速正确DNA分析；强大的批量分析功能；便捷的数据库输出；自动打印标准化实验室报告。

Attractor多色自动快速批量分析软件：

独家专利全自动设门技术可快速

准确圈定客户自定义的目的细胞群；最小群体标色算法便于分辨小群体

ReticCOUNT网织红细胞计数自动化软件：

自动设门分析报告网织红细胞计数，检测重复性好，低水平网织红细胞也可达到可靠的统计精度。

QuantiCALC标准荧光定量分析：

分析获取QuantiBRITE试剂或微球的资料时，FL2轴自动转化为每个细胞上抗体数（ABC）自动进行荧光定量；无限的条带设置充分满足对所有感兴趣细胞群体的研究；

强大的数据库满足长期研究与大型科研工作需求

Paint-a-gate相互作用多维资料分析软件：

独家专利混色算法可同时分辨与显示多个细胞群体；强大的上色工具为研究复杂资料间相互关系提供帮助。

2、全面的配套试剂

BD公司提供通过FDA标准的体外诊断临床试剂和广泛的科研试剂，并拥有全面的质量控制和质量保证产品线以确保检测结果的可靠性：

包括仪器状态、实验方法全程控制、绝对计数控制以及试剂配套中一致性检测等，如：

CaliBRITE微球配合全自动软件FACSComp可自动进行仪器的灵敏度、补偿等校正，确保仪器正常运行。

其设置条件还可用于淋巴细胞分析。

BDMulti-Check全血质控试剂全程监控免疫表型分析检测结果的准确性。

BDMulti-CheckCD4LOW为艾滋病检测提供标准。

BDStemCountControl为CD34阳性细胞检测质控物，监控CD34造血干细胞检测结果。

TruCOUNTControl可确保绝对计数的线性精度。

DNAQC保证DNA分析的线性与分辨率均达到最佳。

（详见试剂报价单）

另外，PMG、TL、Clontech等BD子公司的涵盖细胞生物和分子生物各领域的试剂供应将满足您多方位的需求。

（详见附录2BD公司全球及中国业务介绍）。

3、样本制备仪

◆免疫样本制备仪

BDFACSSampleProcessSP-1采用免洗程序，为细胞免疫表型分析提供自动化样本处理，简单易学，安全性好。

◆DNA样本制备仪

BD公司的Medimachine系统是一套安全的，标准化的样本制备系统，可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离，为流式分析、细胞培养、或DNA扩增技术提供高质量的样本，是对各种类型的组织实现标准化的样本处理的最佳选择。

4、售后服务

BD公司深知每一台仪器正常运转的重要性，所以每一台FACSCalibur、每一个软件和每一个试剂背后都有着最及时、最专业的支持。

BD总部率先建立了流式行业第一个在线远程诊断系统，用户通过互联网和BD总部进行实时的网上交流，BD技术支持专家在自己的计算机上看到用户的问题并迅速提出评估和解决方案。

在中国，BD建立了专业资深、经验丰富的工程师队伍和技术支持队伍，为用户提供仪器安装调试、维修保养、技术培训和咨询等服务。

另外来自BD、PMG、CLONTECH、TransductionLaboratory等总部科学家们的不遗余力的技术支持也是我们的有力后援。

BDFACS品牌流式细胞仪在中国的二十年发展，拥有由一大批国内知名专家、教授组成的用户群体，他们也成为了BD流式技术在中国推广、发展的主要动力。

BD公司每年召开的用户大会，论文交流和新技术介绍讲座，以及定期出版的FlowCytometry专业技术杂志保证了用户及时了解最新的技术进展和相互交流。

（三）FACSCalibur仪器主要技术参数：

参数项目

参数指标

功能特点

标准激光器

*第二激光器

15mw，488nm气冷氩离子激光。

用于3色荧光分析

635nm半导体激光

实现完美四色分析

厂家保证激光管寿命≥5000个小时

通过双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析：

即第一激光器激发的三色荧光与第二激光器激发的第四色荧光之间不会互相干扰，最大限度地减少了荧光信号的重叠（各吸收峰相差55nm以上）；

增加了荧光染料的可选择范围

可选荧光染料：

FITC、PE、PerCP*、PI、APC、CY-5、AO等

光斑大小

22X66umLaser1

13X66umLaser2

流动室

430umX180um

测量参数

FSC，SSC，FL1，FL2，FL3,FL4

*光电倍增管

光谱检测范围300nm-1100nm

电压150V-990V

电压较小，灵敏度大

最小检测颗粒大小

0．2um（min）

50um（max）

检测灵敏度

≤100MESF

检测分辨率

CV<2%（全峰宽）

*样本获取速度

>10，000个/秒（标准）

*脉冲处理系统

BD专利，能同时分析峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度

用脉冲宽度和面积可区分双连体细胞（如假四倍体细胞），减少假阳性结果

*分选装置

300个/秒

目前唯一可做细胞分选的台式流式细胞仪，操作简单，无须长时间稳定液流。

分选纯度达99.99%，

全封闭液流系统实现无菌分选。

*工作站

FACStation

MacintoshG4/733

256MRAM

40GBHardDisk

CD-RW

100MBZipDrive

MacOS9.1

具有网络功能，能与普通微机连网

苹果电脑具有超强的图形处理功能；

100MBZip外存盘，体积小，容量大，为回顾性研究带来方便；

多媒体系统；

不易感染病毒

与PC机的兼容性的解决之道：

免费下载的WINMDI2.6在PC上轻松分析苹果获取的数据。

*软件系统

主软件：

CellQuest

多种全自动软件：

FACSComp

Modifit

Attractors

SimulSET

MultiSET

HLA-B27

ProCOUNT

Paint-A-GATERetiCOUNT

QuantiBRITE（可选）

CBA（可选）

主软件CellQuest是在视窗平台下开发，集获取，分析和分选为一体，主要特点：

1.多窗口

2.具有实时分析（online）功能

3.自动软件方便临床试验，保证1分钟之内出报告

直方图和点图坐标分辨率

1024和256channel

1024X1024channel

256X256channeL

*进样口与检测点距离

15cm

距离短，所需样本量少，节约单抗；

距离短，减少了样本之间的相互干扰

*自动清洗系统

B-D专利

换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰

*鞘液

一般生理盐水或双蒸水

降低了实验成本

滤光片

可更换

可根据实验者采用的标记荧光素的不同发射光波长选用合适的光学滤片

全程质控

FACSCalibur