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视细胞浓度加入100〜500U1固定液）

FCM检测或制片后荧光显微镜下观察

（标本在试管中可保存5〜7天）

（二）试剂和器材

1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗讯或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血淸。

3.10%FCSRPMI1640,DPBS.洗涤液、固定液（见附录）。

4・玻璃管、塑料管、离心机.荧光显微镜等•

（三）注意事项

1.整个操作在49下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂绘高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落.

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色.

附：

LDPBS（X10,贮存液）

NaCl80g

KC12g蒸馆水加至1000ml

Na2HP0411.5g临用时用蒸馅水1：

10稀释

KH2P042g

2-洗涤液

DPBS900ml

FCS50ml（终浓度5%）

4%NaN3?

?

50nl（终浓度0.2%）

3.固定液

DPBS1000ml

葡萄糖20g（终浓度2%）

甲醛10ml

NaN30.2g（终浓度0.02%）

我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：

1•取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里.PBS洗三遍。

注意：

有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不更太冲，不要细胞冲下来.洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟.

2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍•

3・0.2%TritonX-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍.

5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍.

6•二抗室温2小时（避光人或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7•最好用DAPI染核，然后宜接照荧光片.

8•蒸馆水洗掉PBS,甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不線树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

建议：

1•还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问題，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会袒灭的。

2•荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子•3•二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

直接免疫荧光法测抗原

基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，宜接与相应抗原反应•其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。

缺点是敏感性偏低；

而且毎检査一种抗原就祷要制备一种荧光抗体•此法常用于细菌.病毒等微生物的快速检査和肾炎活检.皮肤活检的免疫病理检査.

试剂与仪器

•磷酸盐缓冲盐水（PBS）:

0.01mol/L,pH7・4

•荧光标记的抗体溶液：

以0.Olmol/L,pH7・4的PBS进行稀释

•缓冲甘油：

分析纯无荧光的甘油9份+pH9・20.2M碳酸盐缓冲液1份配制

•搪瓷桶三只（内有0.Olmol/L,pH7・4的PBS1500ml）

•有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

•荧光显微镜

•玻片架

•滤纸

•37'

C温箱等•

实验步骤

1.滴加0.01mol/L,pH7・4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盘标本，置于有孟搪瓷盒内，保温一定时间（参考：

30min）0

3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L>

pH7・4的PBS冲洗后，再按顺序过0・01mol/L,pH7・4的PBS三缸浸泡,每缸3-5min#不时振荡。

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分.但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5.立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；

（±

）极弱的可疑荧光；

（+）荧光较弱，但淸楚可见；

（+十）荧光明亮；

（卄+f卄）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“卄”以上.而各种对照显示为（土）或（"

）,即可判定为阳性。

注意事项

1.对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1:

20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。

染色温度多采用室温（259左右）,高于37・C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0・29的低温，延长染色时间。

低温染色过夜较37-C30min效果好的多。

3.为了保证荧光染色的正确性，tr次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

（1）标本自发荧光对照：

标本加”2滴0.01mol/L,pH7・4的PBS.

（2）特异性对照（抑制试验）：

标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

（3）阳性对照：

已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体•

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4.一般标本在高压汞灯下照射超过就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本垠好在当天观察，随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

间接免疫荧光法测抗体

染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37C保温SOmin,便抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。

第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗1衣・1出抗体。

如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合.从而可鉴定未知抗体。

•磷酸盐缓冲盐水（PBS）：

0.01mol/L,pH7.4

分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制。

•荧光标记的抗人球蛋白抗体：

以0.01mol/L,pH7・4的PBS进行稀释•

•搪瓷桶三只（内有0.01mol/L,pH7・4的PBS1500ml）

•有盖搪瓷危一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

C温箱等。

1.滴加0.01nol/L,pH7・4的PBS于已知抗原标本10min后弃去•使标本片保持一定湿度。

2.滴加以0.01mol/L,pH7・4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。

将玻片置于有盖摘瓷盒内，37*C保温30mino

3.取出玻片，置于玻片架上，先用0.Olmol/L,pH7・4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过O.Olmol/L,pH7・4的PBS三缸浸泡，每缸不时撮荡•

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。

5・将玻片平放在有盖搪瓷盒内，379保温30mine

6•車复操作3。

7.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

8.荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

1.荧光染色后一般在lh内完成观察，或于49保存4h,时间过长,会使荧光械弱。

2.每次试验时，需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：

阳性血清+荧光标记物

（2）阴性对照：

阴性血清+荧光标记物

（3）荧光标记物对照:

PBS+荧光标记物

3.己知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

1、问：

用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？

参考见解：

只是固定方法不同.细胞固定用甲醉，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。

2、问：

近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注盍:

事项？

我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染.我的经验是：

（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的,我用的是donkeyant卜rabbit-FITC（绿）donkeyanti-rat-Tex-Red（红）•

（2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背最比较清晰.

（3）我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物.

（4）封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donk巳y血淸.

（5）其余步骤同一般免疫荧光总标操作。

3、问：

本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：

（1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗空中进行？

（2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0,5mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等址混合封片？

（3）免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？

（1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；

（2）封片最好用甘油加65mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；

（3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3<

yoH202以去除内源性过氧化物酶；

2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与己经掺入的Brdu结合.

4、问：

做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？

最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。

（1）空白对照：

如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。

标本直接滴加二抗，呈阴性反应.

（3）抗原对照：

标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体•因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应.

5、问：

我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好：

有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢？

激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问題，如是不是藪外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问題，那就以共聚焦显微镜的结果为主。

免疫荧光技术基本原理（图）

免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术（Immimofluorescencetechnique）,又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种.它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

Coons等于1941年廿次釆用荧光素进行标记而获得成功。

这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）・

用荧光抗体示踪或检査相应抗廉的方法称荧光抗体法；

用已知的荧光抗原标记物示踪或检査相应抗体的方法称荧光抗原法.这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色第不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术.以荧光抗体方法较常用.用免疫荧光技术显示和检査细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术.

该技术的主要特点是：

特异性强、敏感性高、速度快。

主要缺点是：

非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂.

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。

与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广.国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产.

由于一般荧光測定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定绘测定有一定困难。

近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用.

1.原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。

由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以査出另一个因素。

免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色毅标记在抗体（或抗原）上,与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法：

将标记的待异性荧光抗体，宜接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法：

如检査未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗休）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体〉与抗原标本反应，使之形成抗原一抗体一抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。

如果检査未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗休，其它步骤的抗原检査相同。

标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。

2.技术分类：

（1）荧光抗体技术（荧光显微镜技术）

抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。

⑵免疫荧光测定技术：

抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。

（1）荧光物质

1）荧光色素

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。

只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色索或荧光染料.常用的荧光色素有：

（1）异欣帆酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。

分子量为389.4,最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm,呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：

有两种同分异结构，其中异构体I型在效率、稳定性.与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。

其主要优点是：

①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色.

（2）四乙基罗丹明（rhodamine,RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙銅。

性质稳定，可长期保存。

结构式如下：

最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595〜600nm,呈橘红色荧光。

（3）四甲基异硫氟酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）结构式如下：

最大吸引光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。

与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。

其异硫氨基可与蛋白质结合，但荧光效率较低.

（CH3）2N—（ch3>

^

c

（2）其他荧光物质

1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具冇强荧光的物质。

例如4-甲基伞闱••卩-D半乳糖昔受卩-半乳糖昔酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm,发射光波长为450nmo其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷駿盐和辣根过氧化物酶的底物对轻基苯乙酸等。

2）编系螯合物某些3价稀土钏系元素如鸽（Eu3+）、钦（Tb3+）、饰（Ce3+）等的養合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。

Eu3+S合物的激发光波长范囤宽，发射光波长范囤窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定・

（3）常见荧光蟻：

1）FITC

2）RB200

3）TRITC2

4）舗系：

Eu3+sTb3+

5）PE

6）其它

常见荧光素的特性：

1）FITC：

黄色结晶粉末，吸收光：

490〜495nm,发射光：

520〜530nm.明亮的黄绿色荧光。

2）RB200：

橘红色粉末，吸收光57011m,发射光595〜600mm橘红色荧光。

3）TRITC：

紫红色粉末.吸收550nm,发射光620nm,橙红色荧光。

4）鴛系：

Eu3+.Tb3+

5）PE：

吸收光490〜560nm,发射光595nm,红色荧光.

6）其它：

酶作用后产生荧光物质。

酶作用后产生荧光物质：

酶

底物

产物

激发光

发射光

B-G

MUG

360

450

AP

MUP

MU

HRP

HPA

二聚体

317

414

（4）合适荧光倉的选择

1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。

荧光素-N=C+NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质

IIIIIII

SHH5H

2）荧光效率高，标记后下降不明显。

3）荧光色泽与背最色泽对比鲜明.

4）标记后能保持生物学活性和免疫活性

5）标记方法简单、快速.

6）安全无毒。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗殍育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：

0.01MPBS（1：

1）。

条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久❾

5、荧光抗体的弊育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，希要分别设定阳性和阴性对照.

二、注意事项

1、荧光染色后一般在lh内完成观察，或于49保存4h,时间过长，可能会使荧光提前衰退.

2、每次试验均需设置以下三种对照：

阳性血清+荧光标记物；

阴性血清+荧光标记物；

（3）荧光标记物对照：

PBS+荧光标记物.

三、免疫荧光双标的经验之谈

1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用

donkeyanti-rabbit-FITC（绿）^0donkeyanti-rat-Tex-Red（红）・

2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、靜育时间要自我摸索，我感觉一抗49孵育过夜比较好，背象比较清晰.

3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血消。

5、其余事项同免疫荧光单标操作。

免疫组化中抗体选择要求

1、一抗选择要点

<

1）选择单克隆还是多克隆抗体。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样.另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

在抗原抗体反应中，一般单克障抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；

而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等有所避免）・

（2）种屈来源。

一般家兔来源的抗体多是多克隆；

而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外.这条主要耍与后面的二抗来源相匹配。

（3）实验目的是检测什么种属的抗原，即speciesreactivity.这一点很車要，一般说明书上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。

4）能否做免疫组化.一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。

5）检测标本类型.用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗休，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。

（6）生产厂家。

我的经验是国外著名抗体生产商原装抗体质址一般没问題，但有点贵；

而国内分装厂家用的一抗工作液,价格便宜，但有时结果的稳定性和重烫性稍差，尤其不同批次重复性较垄。

（7）价格与质址的矛盾。

我个人认为一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差（若时间长），但价格较贵。

2、二抗选择要点

（1）种属来源。

主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）・

（2）标记物的选择。

有HRP、Biotin、荧光素等标记物。

一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应；

而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC.Cy3等常用荧光素。

这主要与后面有无三抗和三抗种类有关。

（3）选择IgM还是IgG。

一般一抗是IgM,那么二抗就选择IgM；

反之，一抗是IgG,则二抗选择IgG.

（4）生产厂家.--般SP三步法我们实验室选择中杉金桥的二抗染色试剂盒，内含有工作液的二抗，故试验中只需摸索一抗的浓度即可，效果还可以；

而免疫荧光的二抗我一般选择JacksonImmnoResearch公司，