ADVIA2120原理资料.docx

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ADVIA2120原理资料

ADVIA2120分析原理

基本原理

1．Flowcytometry流式细胞学原理

待检样本在反应池中与试剂进行前处理，再经由仪器液路控制进入Flowcell（流动比色池）进行测定。

Flowcell测定的原理主要是应用特定的光源打在血球上产生散射，并利用设置在不同角度的信号探测器，探测光线散射和吸收的情况，经过信号分析运算就可以得到相关的血球特性资讯（如：

体积，内容物浓度，密度），配合多个不同的Flowcytometry装置所收集足够的血球信息，就能够得到完整的血球计数以及分类的结果。

2.MIE光散射理论

MIE光散射理论：

光线照射在颗粒上所造成之光散射强度测定公式如下

S=F（，，，，）

S散射光强度使用波长折射率容积测量角度形状因子

应用以上公式，固定其中几个因子，就可以测定出血球或者特定颗粒的折射率与体积

若将血球球形化，应用固定波长的光源，设置两个固定角度的光线探测器（高角度H，低角度L），带入这个公式：

SL=F1（，，，L，）

SH=F2（，，，H，）

分解这个方程式可以得到容积与折射率的计算方式：

容积=f1（，SL，SH，L，H，）

折射率=f2（，SL，SH，L，H，）

应用MIE光散射理论，将可测定出血球的体积（容积）与血球的内容物浓度（折射率）。

3.ClusterAnalysis群组分析

当血球细胞经过Flowcell测定后，可得到血球细胞分布图（如下），如何通过统计学与电脑运算方式来界定各种类细胞，是血球分析仪是否准确的重要因素，其中：

ClusterAnalysis（群组分析）普遍应用在血球分析，此技术能精确的计算出如下数个群组的分界，不但定义出正常的细胞族群，对于异常细胞的出现也能提供敏感的讯息。

4.UFC（Uni-FluidicsCircuit）集成流路系统

集成流路系统就是将传统血球记数仪中所应用的管路，反应池，控制阀，试剂运送，管路清洗等功能加以整合，利用UFC特殊材质的去极性及无变形的特性，增加仪器的稳定度与降低定期保养工作频率。

5．光源

应用最新科技的二极管激光发生器，具有光源稳定，体积小，寿命长的特性。

LASERSCATTER激光散射测定

测定项目：

RBC/PLT，BASO，RETIC

DARKFIELDOPTIC卤素灯测定

测定项目：

白血球分类

6．Flowcell结构

1．Flowcell2.shuttleNipple3.SampleNipple4.SheathNipple

5.OpticsLens6.Mirror7.Lowangledetector8.Hiangledetector

9.lightsource

Flowcell运作原理：

鞘液经由SheathNipple进入Flowcell形成一稳定介质，再将处理过的细胞（稀释，染色或球形化）经由SampleNipple以稳定的流速注入Flowcell，当细胞通过光源时会因不同的细胞特征（体积，染色程度，血红素浓度或核密度）产生不同程度的散射，再由Flowcell后方两个探测器（高角/低角）测定光线变化，两个探测器所收集到的信号加以分析计算，就可以得到所需要的细胞特征。

7.RBC/PLT反应测定原理

测定项目：

红细胞计数与形态分析

反应：

稀释，球形化，固定

全血样本2ul与RBC/PLT稀释液1250ul混合，形成625倍稀释，此步反应主要是将红细胞形态改变，由原来的“双凹圆盘型”改变为‘球形’即球形化，试剂中含有固定剂可以使改变形态的红细胞保持稳定，以利于光学法测定细胞体积与血红素浓度。

MIE光散射理论的应用

血液经前处理后，样本中所含的红细胞，血小板等均呈圆球状，经由流体力学的控制，血球可以依序进入Flowcell，并通过激光照射后出现不同的光散射，利用高/低角度探测器分别测量在此两角度的吸光度变化，就可以测定出细胞的物理特性：

如细胞体积，内容物浓度，血红素浓度等参数。

MIEMAP

MAP直交展开

红细胞分布图（九分图）

1.60fl2.120fl3.28g/dl4.41g/dl

红细胞分布图相对位置

红细胞碎片2.高色素红细胞3.红细胞4.血小板

1.小红血球阈值2.大红血球阈值3.低血色素阈值4．高血色素阈值

血小板分布图相对位置

1.血小板2.大血小板3.红细胞

4.红细胞碎片5.噪音6.红细胞阴影

8．BASO通道测量原理

主要反应：

破坏红血球，血小板，白细胞裸核化

全血样本12ul与BASO稀释液500ul混合，形成41.6倍稀释,BASO稀释液为强酸性溶液可将样本中红细胞，血小板，以及嗜碱细胞（保持原态）以外的所有白细胞（裸核化）加以破坏，在经由流体控制将嗜碱细胞及裸核化的白细胞送入Flowcell,当血球经过激光照射后，应用MIE理论，测定高/低角度信号变化，就可以得出细胞体积与核密度。

MIE光散射理论之应用

如上图，为BASO通道细胞处理后示意图，低角度散射光变化可以测出细胞体积，高角度光为核密度，形成右下角的细胞分布图，其中，嗜碱细胞因为保留完整的细胞膜。

体积相较之下比其他白细胞的裸核大，因此分布在细胞分布图的上方，其余的裸核则聚集在细胞分布图的下半部分，且依照其细胞核的核密度分布，越靠近X轴左边表示核密度低或者单核，越靠近X轴右边表示核密度高或者多核。

单个核白细胞分布在左半区，包含：

Monocyte,Lymphocyte,

多个核白细胞分布在右半区，包含：

Eosinophil,Neutrophil,NRBC

利用单核细胞与多核细胞的分布就可以算出LobularityIndex,如图所示，此Index为以前判断是否左移的主要依据

BASO通道细胞分布图（正常状态）

1.噪音2.原始细胞3.MN（单核）4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱6.饱和区7.PMN（多核）8.NRBC（有核红细胞）

BASO（PMN/MN）不能清楚分辨时，将出现以下分布图

1．噪音2.原始细胞3.MN（单核）4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱6.饱和区7.PMN（多核）A.Noise/Baso阈值B.原始细胞阈值C.MN/PMN阈值D.BASO/裸核阈值E.BASO/饱和阈值

9.Retic

反应：

红细胞球形化及RNA染色

全血样本2ul加入autoretic试剂1250ul混合

试剂中含有RNA染剂Oxazine750,可渗透至网织红细胞细胞膜内，将细胞质内的RNA加以染色，细胞质内含有RNA的网织红细胞将被染成蓝色，且依照RNA含量的多少反应染色的程度，细胞膜内不含RNA的红细胞与血小板则不被染色。

网织红细胞的成熟过程：

Heilmeyer成熟度分期

网织红细胞成熟过程的分期主要以活体染色后，RNA染色的形态及RNA含量作为分类依据，以下为网织红细胞的分期与存在位置。

OType:

具有染色颗粒与细胞核的有核红细胞

-

Type:

具有RNA染色颗粒的无核红细胞。

MIE光散色理论应用：

计算细胞数量及特性分析

利用RBC/PLTChannel的光学系统，当细胞通过激光产生散射，再利用信号探测器测量各角度散射光强度，应用MIE原理计算：

低角度散射光可测定出细胞体积，高角度散射光可测定细胞血红素浓度，吸光度变化的测量可以计算出RNA染色浓度，利用以上三个测定植就可以得到完整的网织红细胞分析。

网织红细胞分布图

Retic/PLT阈值2.同时通过细胞阈值3.Retic/MatureRBC阈值4.Low/Med阈值5.Med/High阈值A.成熟红细胞B.低吸光ReticC.中吸光ReticD.高吸光ReticE.PLT/Retic阈值F.同时通过细胞

每颗网织红细胞所含的Hgb含量计算公式：

MCH（pg）=MCV（fl）*MCHC（g/dl）/100

10.PEROX白细胞分类（过氧化酶染色）

反应：

破坏红细胞，加热固定白细胞，过氧化酶染色

第一步骤：

全血样本12ul加入250ulPerox1,反应池加热到70度进行红细胞破坏之反应及

第二步骤用Perox1中甲醛固化WBC及包膜皱缩。

（17秒）

第三步骤：

同时加入125ulPerox2，主要成分为4Chrolo-1Naphol之呈色剂，及250ulPerox3，主要成分为H2O2，为过氧化酶反应中的底物，释放出O与呈色剂反应，在胞浆中产生黑色沉淀.

（13秒）

H2O+4Chrolo-1Naphol---过氧化酶细胞--------细胞内黑色沉淀

测定：

染色后的白细胞利用光学法测定染色程度，细胞体积，细胞数量

白细胞过氧化酶活性：

Eosinophil:

4+，Neutrophil:

2+to3+，Monocyte:

weak+

Lymphocyte:

negativeBasophil:

negative

染色后的白细胞通过Flowcell时，透过卤素灯为光源的白色光照射将造成不同程度的光线散射，利用Flowcell后方的两个探测器探测散射光的强弱，即可测定出白细胞的体积。

染色程度，组成过氧化酶染色的细胞分布图

PeroxidaseCytograme细胞分布图

1噪音（红细胞，血小板碎片）2.有核红细胞3.血小板凝集4.淋巴+嗜碱5.LUC6.单核7.中性8.嗜酸

11.Hgb血红素

反应：

氰化血红素比色法

全血样本2ul加入500ulHgb稀释液，主要成分为KCN及表面活性剂，可以将样本中的红细胞破坏，红细胞中的血红素与KCN反映呈色后，测定透光度的变化，再以鞘液的透光度作为背景值，利用透光度和背景值的差值就可以计算出样本中血红素的浓度。

测定光源波长：

546nm

前一样本2.样本与试剂打入反应池3.血红素透光度测定

4.反应池清洗5.鞘液透光度测定

12，MophologyFlag判定标准

1．ANISOCYTOSIS（ANISO）

+RDW=16.0%to17.9%

++RDW=18.0%to22.0%

+++RDW>22.0%

2．MICROCYTOSIS（MICRO）

+%MICRO=2.5%to6.4%

++%MICRO=6.5%to10.5%

+++%MICRO>10.5%

3．MACROCYTOSIS（MACRO）

+%MACRO=2.5%to6.4%

++%MACRO=6.5%to10.5%

+++%MACRO>10.5%

HGBCONCENTRATIONVARIANCE（HCVAR）

+HDW=3.4g/dLto3.9g/dL

++HDW=4.0g/dLto4.5g/dL

+++HDW>4.5g/dL

HYPOCHROMIA（HYPO）

+%HYPO=4.0%to7.9%

++%HYPO=8.0%to12.0%

+++%HYPO>12.0%

HYPERCHROMIA（HYPER）

+%HYPER=4.0%to7.9%

++%HYPER=8.0%to12.0%

+++%HYPER>12.0%

ATYPICALLYMPHOCYTES（ATYP）

+%LUC=4.7%to7.4%

++%LUC=7.5%to10.0%

+++%LUC>10.0%

LEFTSHIFT（LS）

ThisflagistriggeredifBASOd/Dislessthan0.15.

Thisflagisnottriggeredif%NEUTislessthan30%.

+LI>1.9

++LI=1.7to1.9

+++LI<1.7