福建林学院学报.docx

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福建林学院学报

福建林学院学报2007，27（3）：

267—271

春兰菌根真菌的筛选

伍建榕，金辉，韩素芬，朱有勇，吕梅，王光萍

（1．西南林学院西南生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南昆明650224；2．南京林业大学森林资源

与环境学院，江苏南京210037；3．云南农业大学植物病理重点实验室，云南昆明650201）

摘要：

地生兰组织培养存在移栽无菌苗成活率低、生长缓慢、开花迟缓、花小甚至不开花等问题，这些与缺少共生的菌根真菌有关。

用分离自云南保山、大理等地野生春兰菌根中的内生真菌19个菌株接种春兰组培幼苗，经4．5个月的共生培养，兰苗叶色正常，根系生长良好。

测定植物生长量，从长势有明显提高的接菌苗进行重分离及菌根的显微结构观察，确定春兰菌根的形成，并筛选出春兰的有效共生菌根真菌为CLB111，CLB113和MLX102。

通过接种处理后春兰苗的鲜重增长率分别为70．6％、70．2％、68．6％，而不接菌的对照仅为45．6％，与对照差异达0．01极显著水平。

结果表明这3个菌株均为春兰的菌根真菌的优良菌株．

关键词：

春兰；菌根真菌；接种；筛选

中国兰花指产于我国的兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物，而且主要指其中的地生兰⋯，春兰（CymbidiumgoeringiiRchb．￡）就是其中的一种。

由于组培苗缺乏菌根真菌，移栽无菌苗成活率低，生长缓慢，开花迟缓，花小甚至不开花。

本试验通过分离自野生春兰的内生真菌与春兰组培苗的共生培养，筛选出能与春兰组培苗共生并能明显促进其生长发育的有效菌根真菌，对春兰的商品化生产有重要的现实意义。

从兰花根部分离获得的真菌究竟是否为菌根真菌，必须通过接种试验进一步证实。

Bernard【2指出在兰科菌根中，真菌与寄主之间的专一性并不十分严格，但某种菌根真菌与哪种兰科植物能更有效地共生，也有明显的倾向，且兰花与菌根真菌的共生是一种偏利性的共生，即对兰花生长更有利。

有时已经被一种真菌感染的根部，甚至已具有胞内菌丝团的细胞有可能出现被另一种菌根真菌的菌丝侵入的现象。

兰科植物形成有效菌根至少具备4方面特征：

1）植物的生物量有显著增加，一般认为兰花可以通过菌根真菌获得更多的营养，促进其生长，即菌根真菌对兰花生长更有利；2）菌根真菌侵入营养根皮层细胞后形成了菌丝团等兰科菌根的典型结构；3）重分离能获得接种的真菌；4）通过分子生物学的DNA检测，以确定兰花菌根的形成，并筛选出与该兰花有效共生的菌根真菌。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1春兰的种子繁育组培幼苗采自云南保山、大理、元江、怒江等地自然生长的春兰蒴果，待果皮由绿稍转黄时采摘，4℃下保存1个月待用引。

1．1．2栽培基质苔藓、蛭石、建筑用砂、用松软的红砖破碎成直径O．3—1．5cm的颗粒，放人盆底到1／2地方，表面再覆盖水苔。

1．1．3供试茵株从分离获

得的菌株中选择有可能并具代表性的菌株（从野生春兰中分离获得频率较高的内生真

菌）进行接种J，见表1。

1．1．4真茵培养基一级菌种：

PDA培养基。

二级菌种：

平板和新鲜壳斗科麻栎叶（Querc~acutissima）o表1春兰盆栽接种菌株

1．1．5兰花营养液配方共生培养过程中，所用兰花培养液组分见表2。

表2兰花营养液配方

1．2方法

1．2．1兰花种子繁育组培幼苗的培育蒴果均采用升汞消毒法进行消毒。

无菌条件下将蒴果放人75％酒精浸泡10s，用0．1％升汞摇晃15—20min，无菌水清洗3次，再用0．1％升汞摇晃3—4min，然后用无菌水清洗3次，再将消毒的蒴果平置于灭菌培养皿中。

用手术刀徐徐纵向切开果皮，将种子均匀撒播于培养基内，每个蒴果播15瓶。

播种后将培养基置于光照度为1500—2000Ix、相对湿度80％一90％、25oC条件下培养，3O一40d开始抽出嫩芽后进行继代和生根培养。

1．2．2春兰、真茵共生基质筛选将苔藓、蛭石、建筑沙及以上3种各占1／3混合均匀的共生基质放人白瓷盘中121oC灭菌1．0—1．5h，苔藓在使用前先用清水浸泡，淋洗，挤干水分剪碎。

1．2．3真茵的培养将供试菌株接种在PDA培养基上，25℃恒温培养，待菌丝长满平板后作为一级菌种。

然后将一级菌种接种到无菌的壳斗科麻栎叶片培养[采新鲜麻栎叶清水洗净凉干，剪成小片（O．5cmx0．5cm），装入组培瓶中121oC灭菌45min]，25oC恒温培养14d至菌丝长满叶片作为二级菌种，用作兰花种子繁育组培幼苗的接种J。

1．2．4兰花与真茵的共培养先将兰花组培幼苗从光照培养箱中取出放在室温1周，使其适应；再于无菌超净台上将组培兰苗移人基质中，1周后，叶色转绿后接菌。

幼苗接菌前先编号，然后将苗在无菌环境下取出，用无菌蒸馏水冲洗，无菌吸水纸吸干水分，称取鲜重后重新植回原位（天平精度为0．001），同时将染菌的麻栎叶剪成小块（O．5cmxO．5cm）放于根周围，与根相距约0．5cm，再用基质把根盖好，继续在保湿、温暖的室温下生长，每日喷2—3次蒸馏水。

同时设2组对照（不加麻栎叶为CK1，加不染菌麻栎叶为CK2），每处理重复2—3次，每处理苗数为3O株。

接菌后第2周开始，每星期喷施1次营养液，经常观察兰苗生长情况。

1．2．5春兰组培苗与真菌共生生物量测定培养4．5月后，将苗取出并再次称取鲜重，比较其增加量，

即：

（处理后鲜重一处理前鲜重）100／处理前鲜重。

9个月后的长势见图1。

1．2．6接种菌株的重分离取处理苗的新鲜营养根，长约4—5cm，清水冲洗，再用75％的酒精处理20—3Os，0．1％的升汞溶液表面灭菌4—5rain，无菌水清洗4—5遍，在无菌培养皿中横切成3—21TLrn薄片，置于PDA培养基上，切面朝向培养基，每皿放3—4块组织，25℃恒温培养。

当从组织块上长出的菌丝形成小菌落时，从边缘挑取菌丝移到另一PDA培养基上，重复至纯培养，转入斜面保存，并鉴定。

1．2．7石蜡切片的制作取新鲜营养菌根（内生真菌与组培幼苗共生体系）从根尖一端截取3—4cm长根段，流水冲净，切成51TLrn长的小段，FAA固定24h后经一系列酒精脱水，石蜡包埋，旋转切片机连续切片，厚度8m，番红固绿对染，中性胶封片，光学显微镜观察及照片见图2。

2结果与分析

2．1春兰鲜重增长率

从春兰SPSS统计结果中，在春兰的19个接菌处理中，大部分幼苗叶色正常，根生长正常（表3）；接菌处理苗有少数死亡现象（CLD118、CLD119镰刀菌属）外，其余的lO个菌株接种苗的鲜重增长率与对照相比都有不同程度的提高。

经方差分析和多重比较，与对照达到了显著差异，其中CLB111、CLB113、MLX1023种菌株与对照差异已达到极显著水平（表3、4），图3为与对照达显著差异的lO个菌株处理平均鲜重增长率。

2原菌株获得及皮层菌丝结分布情况

从表3、图2中结果可见，处理春兰苗营养根经重分离，部分获得原接种菌株，l3个菌株接种春兰根后在营养根的石蜡切片中均能观察到菌丝结。

表4接菌对春兰组培苗生长平均鲜重增长率方差分析

3结论与讨论

1）不同菌株处理对春兰组培苗的影响有明显差异，试验中有1O个菌株接种苗的鲜重增长率高于对

照并达到差异显著，其中CLB1l1、MLX102、CLB113三菌株与对照差异已达到极显著水平。

兰科丝核菌类菌株MLX102、CLB113和丝核菌属CLB111能显著促进春兰组培苗的生长，这与在兰科内生真菌分离试验中，兰科丝核菌类和丝核菌属是经常出现的2类真菌菌株相符合，并有许多种类已被证实是兰科菌根真菌。

2）试验所用菌株对春兰苗的生长均有明显的促进作用，但处理苗营养根经重分离，部分获得原接

种菌株，部分在重分离中未得到原菌株，这可能有2种原因：

①某些接种真菌与植物形成了有效的共生关系，促进了植物的生长，但在接种菌株的重分离中，由于材料是幼嫩的组培苗，根的角质化程度较低，升汞表面灭菌时间虽缩短为1—2min，但仍然过长，大部分侵入的真菌被杀死而未能分离获得，如CLN113和CLN115未能分离获得原接种菌；不是所有的营养根都有真菌侵入，由于切片取材数量有限、时间集中，因而未能发现菌丝结。

②一些接种真菌虽不能与植株形成共生关系，但具有较强降解和转化能力。

可为兰花提供更多可利用的碳源及矿质营养（如丝核菌和毛壳菌等），促进植物生长；有些真菌可分泌某些激素刺激植物生长（如镰孢菌等）]，这些菌虽不是兰花的菌根真菌，但也是生活在兰花根际并对植株生长有益的真菌。

3）自然状态下，地生兰可以与真菌形成内生菌根并维持一定的共生关系，这些共生真菌广泛地分布于土壤中，而且各种菌的生态分布与该菌的栖息地有关，而不是由寄主决定的。

所以确定分离的真菌是否为共生菌，Warcup[9认为应具备2个条件：

①该真菌必须是从兰科植物细胞中分离的；②将该真菌回接于兰科植物观察是否共生，2个条件必须同时满足。

4）有效菌根真菌是兰科植物形成菌根的必要条件，而兰科菌根真菌多半都是兼性寄生真菌，它们对很多种植物是营寄生生活的病原菌，但对兰科植物则是共生的菌根真菌，在试验过程中，如果接菌量大或是染菌的栎叶离根太近，兰苗容易出现根腐现象。

如果菌量过大，不但不能形成共生关系，反而使植物致病，量少可以慢慢积累，量多将会使植物致病，这里存在着一个量和度的问题。

可以认为菌根中真菌同寄主之间的共生平衡关系也是有条件的¨。

一旦真菌与植株形成共生关系，并且二者长期共存，才能互惠互利。

但量的多少不能超过一个度，在适量的条件下，与兰科植物形成共生体系——菌根，超过度时将会使兰科植物的根发黑，导致根部病害。

既然兰科植物菌根真菌大部分是土壤习居菌，只有种群相对较多带菌量少的土壤基质才适宜种植兰科植物，菌类之间的相克作用，才容易形成菌根，

不至于导致兰科植物根部发病。

这与魏勤等¨研究西双版纳热带兰基质得出兰科植物生境基质中带菌量少，但种群较多，人工栽培的基质带菌量多但种群较少的结果是一致的。