分子药理学.docx

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分子药理学

受体药理学

1.受体：

细胞膜受体：

离子通道型受体、G蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体

细胞内受体：

核受体

2.离子通道型受体：

是细胞膜上的跨膜蛋白质，受体本身构成离子通道，能识别配体并与其特异结合。

当配体与受体结合后，分子构象改变，使离子通道打开或关闭，选择性的促进或抑制细胞膜内外离子的快速流动，产生去极化或超极化，在几毫秒内引起膜电位变化，从而传递信息，产生生物效应。

γ-氨基丁酸（GABA）：

是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（GAD）作用下脱羧而成，是一种中枢抑制性神经递质。

3.G蛋白偶联受体：

Gproteincouplingreceptors，GPCRs

目前研究最广泛、深入的受体类型，已通过分子克隆技术确定了上百种G蛋白耦联受体结构。

此型受体与配体结合后，效应时程一般为数秒到数分钟。

G蛋白偶联系统：

表面受体（七次跨膜）、G蛋白和效应物

G蛋白的活化启动信号转导

信号转导途径的基本模式：

配体+受体——G蛋白——效应分子——第二信使

——靶分子——生物学效应

第二信使：

G-蛋白、cAMP,、cGMP、肌醇磷脂、Ca2+

4.酪氨酸蛋白激酶受体：

与配体结合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰岛素受体、表皮生长因子受体、血小板生长因子受体等。

效应时程一般为数小时。

作用模式：

⑴配体（如表皮生长因子、胰岛素）与受体结合，引起受体二聚化；

⑵二聚体的酪氨酸蛋白激酶被激活，彼此使对方的某些酪氨酸残基磷酸化，这一

过程称为自身磷酸化；

⑶利用酪氨酸蛋白激酶活性进而影响细胞内信息传递体系，产生生物效应

5.核受体：

位于细胞内的受体多为转录因子，与相应配体结合后，能与DNA的顺式作用元件结合，调节基因转录。

效应时程为数小时甚至数天。

高度可变区：

位于N端，为转录激活结构域

DNA结合区：

位于中部，含有锌指结构

铰链区：

含有核定位信号

激素结合区：

位于C端，结合配体或热休克蛋白，含有核定位信号，使受体二聚化，激活转录

作用模式：

⑴在细胞内，受体与抑制性蛋白（如Hsp90）结合形成复合物，处于非活化状态；

⑵配体（如皮质醇等甾体激素）与受体结合，导致抑制性蛋白从复合物上解离下

来，从而使受体暴露出DNA结合位点而被激活；

⑶与靶基因结合，调节其转录、表达，从而影响靶细胞的代谢。

配体与受体结合的部分在细胞膜的外表面，而腺苷酸环化酶在膜的内表面，那么，信息是怎样由受体传到腺苷酸环化酶系统的？

细胞信号转导

1.细胞信号转导的基本路线

细胞外信号——受体——细胞内多种分子的浓度、活性、位置变化——激活的信号转导分子进入胞核——进入胞核的转导分子作用于基因转录调控区——基因表达改变

2.蛋白激酶PK

⑴大多数第一信使→第二信使水平升高→激活蛋白激酶→底物蛋白质磷酸化→蛋白质构象改变，特定生物学效应。

⑵蛋白质磷酸化作用是生物调节最基本和最重要的公共通路。

⑶磷酸化修饰可能提高酶分子的活性，也可能降低其活性，

取决于酶的构象变化是否有利于酶的作用。

⑷蛋白质的磷酸化与去磷酸化是控制信号转导分子活性的最主要方式。

激酶

磷酸基团的受体

蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶

蛋白酪氨酸激酶

蛋白组/赖/精氨酸激酶

蛋白半胱氨酸激酶

蛋白天冬氨酸/谷氨酸激酶

丝氨酸/苏氨酸羟基

酪氨酸的酚羟基

咪唑环，胍基，ε-氨基

巯基

酰基

⑸蛋白激酶是催化ATPγ-磷酸基转移至靶蛋白的特定氨基酸残基上的一大类酶。

⑹蛋白磷酸酶：

催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在。

蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白酪氨酸激酶是主要的蛋白激酶。

分类如右：

3.信息的转导途径

（一）Gs/Gi-AC-cAMP-PKA信号途径：

胞外信号——受体——G蛋白——AC——cAMP

——PKA——蛋白质磷酸化——生物学效应

PKA的作用

（1）对代谢的调节作用：

通过对效应蛋白的磷酸化作用，实现其调节功能。

（2）对基因表达的调节作用

（二）Gq-PLC-DAG/IP3信号途径

PKC的生理功能

（1）调节代谢：

活化的PKC引起一系列靶蛋白的丝、苏氨酸残基磷酸化。

靶蛋白包括：

质膜受体、膜蛋白和多种酶。

（2）调节基因表达

（三）GC-cGMP-PKG信号途径

PKG的功能：

使有关蛋白或酶类的丝、

苏氨酸残基磷酸化。

生物学效应：

ANP：

松弛血管平滑肌、利尿利钠、降血压。

NO：

松弛血管平滑肌、扩张血管。

（四）酪氨酸蛋白激酶途径

酪氨酸蛋白激酶分类：

受体型TPK（位于细胞质膜上）：

如胰岛素受体、生长因子受体

非受体型TPK（位于胞浆）：

如底物酶JAK编码的TPK

（1）受体型TPK-Ras-MAPK途径

组成：

催化性受体、GRB2、SOS、

Ras蛋白、Raf蛋白、MAPK系统

Raf蛋白：

具有丝／苏氨酸蛋白激酶活性

MAPK系统：

包括MAPK、MAPK激酶（MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKKK），是一组酶兼底物的蛋白分子。

Ras蛋白：

原癌基因产物，

类似于G蛋白的Gα亚基

GRB2：

生长因子受体结合蛋白2

SH2域：

能识别磷酸化的酪氨酸残基

并与之结合

SOS：

富含脯氨酸，可与SH3结合，促使Ras的GDP换成GTP

（2）非受体型TPK信号途径（JAKs-STAT途径）

配体与受体结合导致受体二聚化——二聚化受体激活JAKs——JAKs将STAT磷酸化——STAT形成二聚体，暴露出入核信号——STAT进入核内，调节基因表达

STAT：

信号转导和转录活化因子

一氧化氮生物系统及其药理学作用

1.NO的代谢：

⑴很快被氧化代谢，半衰期3～5s，故仅限于局部发挥作用；

⑵代谢产物为硝酸根和亚硝酸根；

⑶NO还可与亚铁血红素和-SH键结合而失活。

2.NOS的生物学分类

①内皮型（endothelialNOS，eNOS），又称Ⅲ型NOS、NOS-3，主要存在于血管内皮细胞、血小板、心肌内膜及脑和神经组织中。

扩张血管，保护内皮

②神经元型（neuronalNOS，nNOS），又称I型NOS、NOSL-1，主要存在于脑、脊髓和外周非肾上腺素非胆碱（NANC）能神经，当相应神经元需要时，催化产生极微量的NO。

神经细胞损伤

③诱生型NOS（inducibleNOS，iNOS），又称Ⅱ型NOS、NOS-2，存在于除神经元外的多种组织中，正常情况下不表达，但在炎症和免疫反应剌激下，iNOSmRNA被诱导表达。

促进炎症反应

3.在GC-cGMP-PKG信号途径中，NO与可溶性鸟苷酸环化酶分子中的血红素铁结合，引起鸟苷酸环化酶构象改变，酶活性增高，由GTP生成的cGMP，作为第二信使，产生生理效应。

4.硝酸甘油扩张血管的机制

5.勃起功能：

阴茎海绵体平滑肌内的cGMP由5型磷酸二酯酶（PDE5）降解，而此作用可被药物西地那非（万艾可）特异性地抑制，从而防止NO引发的细胞内cGMP信号快速消失，维持海绵体平滑肌细胞舒张、增加血流量。

6.一氧化氮对机体生理的作用：

主要在心血管系统、生殖系统、免疫系统。

⑴维持血管平滑肌紧张度；⑵调节离子通道开放；⑶控制血管有关的血流动力学特性；

⑷抑制心肌收缩力；⑸对心肌细胞凋亡的调控；⑹抑制血小板聚集和粘附；⑺抑制血细胞黏附；

⑻调节血管平滑肌细胞增生；⑼促进血管增生；⑽清除氧自由基；

7.NO产生不足会影响心血管系统的正常功能，但另一方面，过量的NO又会导致心脏损伤。

在心肌缺氧条件下，eNOS水平代偿性地增加，从而增加NO的产生，NO继而松弛血管，改善心脏供血；但同时NO又与IRI过程中生成的超氧阴离子自由基协同损伤心肌。

在这一病理生理条件下，NO呈现出典型的“双刃剑”效应，既具有保护作用，又能引起损伤。

8.eNOS与心血管疾病：

⑴NO能激活sGC，通过升高细胞cGMP的水平舒张血管，降低血压，抑制血管平滑肌增殖和血小板粘附。

⑵血管内皮细胞产生的NO对维持心血管系统的正常生理功能有着积极作用。

⑶eNOS基因表达和活性对NO生成和对心脑血管疾病发生、发展产生重要的影响。

自由基损伤学说及抗氧化剂

1.自由基：

是指外层电子轨道带有一个或多个未成对电子的分子、原子、离子或者基团。

2.活性氧（ROS）：

是指分子氧在还原过程中的一系列中间产物。

活性氧包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物。

在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参与机体生长发育的调控，信号转导、诱导增殖与分化、诱导凋亡，调节运动等多种生理过程，在生物体内发挥着重要的功能。

3.超氧阴离子（O2·-）

化学性质：

O2·-在细胞内可直接导致DNA损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生产生H2O2和OH·。

清除：

细胞内有SOD起清除作用。

4.过氧化氢（H2O2）

化学性质：

H2O2的性质较稳定，半衰期最长，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作用。

清除：

H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。

5.羟自由基（OH·）

化学性质：

OH·是已知活性最强的氧化剂，化学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。

但是由于其作用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。

清除：

主要通过抗坏血酸、GSH（或其他的硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细胞色素P450体系降解和清除。

6.过氧亚硝基阴离子（ONOO-）

化学性质：

ONOO-作为一种强氧化剂，可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，导致细胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。

降解：

在碱性条件下，ONOO-比较稳定。

一旦质子化，立即分解产生类羟基和NO2自由基。

7.氧化应激与心血管疾病

氧化应激与动脉粥样硬化、NADPH氧化酶与动脉粥样硬化、氧化应激与高血压

8.自由基的信号转导途径

EGFReceptorProteinTyrosinePhosphatasesInsulinReceptorKinaseActivity

CytoplasmicProteinKinasesMAPKCascadesProteinKinaseCIsoforms

CytosolicCa2+ConcentrationsTranscriptionFactor

9.机体对自由基的防御

10.自由基的检测

⑴化学发光法：

检测原理：

活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。

检测对象：

超氧阴离子、羟自由基、H2O2和脂质过氧化产生的自由基都可以产生化学发光。

优点：

灵敏、快速、操作简单、价格低廉。

缺点：

非特异性。

另外，几乎所有的氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧的检测。

Fe2+也可以产生非常强的化学发光。

⑵二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）：

检测原理：

可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。

用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。

⑶Lucigenin（光泽精）-EnhancedChemiluminescence：

检测原理：

在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶（N2methylacridan）。

并发出450nm的激发光，测量此激发光的强度即可定量产生的超氧阴离子的浓度。

可以定量，检测时间长，并需要新鲜组织样本。

⑷2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）：

检测原理：

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。

而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平。

11.影响自由基的药物

⑴抗氧化药物

①维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维生素A、GSH等；

②活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶、Co-Q类等；

③化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、β2受体激动药及阻断药等；

④中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含的黄酮类、酚类、多糖类等。

⑵促氧化药物

①化学性直接产生自由基及活性氧；

②通过作用于机体防御机制，促进机体内自由基、活性氧产生。

巨噬细胞、中性粒细胞在对侵入机体的抗原通过吞噬作用而进行消化分解的同时，产生超氧化物、过氧化物以破坏抗原。

例：

莫特沙芬进入机体后可选择性定位并在癌细胞中蓄积，破坏细胞代谢，产生ROS并促使细胞凋亡。

临床前研究显示莫特沙芬可加强放疗及几种常用化疗药的疗效。

老年性痴呆发病机理及药物治疗研究

1.老年痴呆症：

又称阿尔茨海默病，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。

2.老年痴呆症（AD）的病理特征：

神经元的变性丢失、大量老年斑的沉积、神经纤维纠缠

3.阿尔采默病的病理改变特点：

⑴神经细胞间的神经炎性斑块（neuriticplaques,NP）

⑵神经细胞内的神经原纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFT）

⑶神经元丧失与突触改变

4.神经炎性斑块（NP）

⑴这种斑块是细胞外的结构，在AD病人的脑中常见，特别是在海马和新皮质中

⑵在AD的神经炎性斑块是一种致密的、不溶性的结构

⑶斑块由中心的ß-淀粉蛋白和周围异常的轴突和树突组成

⑷主要是由β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积所致

⑸Aβ来自淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）经α、β、γ-分泌酶水解而来

⑹α、γ-分泌酶使APP水解成sAPP，具有神经保护作用，阻止Aβ的形成

⑺β、γ-分泌酶则使APP水解成Aβ１-４０或Aβ１-４２

5.神经原纤维缠结（NFT）

⑴细胞内由成对的螺旋纤维组成的包含体表现为典型的双螺旋结构

⑵纤维是由一种被称做tau蛋白的高磷酸化的微管相关蛋白组成

⑶被损伤的神经微管的残余

6.阿尔采默病的发病机制：

β淀粉样蛋白学说、tau蛋白学说、阿尔采默病的分子遗传学

7.β淀粉样蛋白学说：

⑴弥散性斑块——非聚集Aβ——刚果红染色

⑵毁坏性斑块——机制还没认识

⑶老年斑

8.Tau蛋白：

⑴属于微管相关蛋白（MAP）家族，主要分布于神经元轴突内。

⑵主要功能：

促进管蛋白聚集成微管，维持微管的结构。

⑶tau蛋白的异常改变：

AD的PHF中tau蛋白高度磷酸化

9.tau蛋白磷酸化的调节

⑴蛋白磷酸酯酶：

使tau蛋白去磷酸化，如ＰＰ-１、ＰＰ-２Ａ、ＰＰ-２B

⑵蛋白激酶：

使tau蛋白磷酸化，

包括脯氨酸指导的蛋白激酶（PDPK）和非脯氨酸指导的蛋白激酶（non-PDPK）

⑶PDPK：

GSK-3、CDK2/5、MAPK

⑷non-PDPK：

PKA、PKC、CaMK॥

10.蛋白激酶——GSK-3：

受丝氨酸和酪氨酸磷酸化的调节

11.蛋白激酶—MAPK：

主要有3种亚型：

细胞外信号相关蛋白激酶（ERK）、C-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38

12.AD的分子遗传学

⑴早发家族性：

1q31-32,PS2基因，12个外显子，448个氨基酸

14q24.2-24.3,PS1基因，10个外显子，4467个氨基酸，与APP加工转运有关

21q21.1-21.3,APP基因，19个外显子

⑵晚发家族性、散发性：

19q13.2,ApoE基因（有2、3、4三个等位基因）

13.胆碱能退化：

目前的治疗重点

细胞凋亡

1.细胞凋亡：

体内外生理或病理因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动死亡过程，又称程序性细胞死亡。

生理学意义：

确保组织器官正常发育、生长；维持内环境稳定；发挥积极的防御功能。

2.凋亡细胞变化

⑴形态学特征：

凋亡细胞与周围细胞脱接触；胞膜空泡化；细胞皱缩、出芽；核固缩、染色质边集；凋亡小体。

典型的凋亡小体（apoposisboby）：

由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部分组成。

⑵生化改变：

DNA片段化断裂；蛋白质降解。

3.细胞凋亡与坏死的比较

坏死凋亡

1.性质

病理性,非特异性

生理性或病理性，特异性

2.诱导因素

强烈病理性刺激,随机发生

生理性或较弱病理性刺激，非随机发生

3.生化特点

被动过程,无新蛋白合成,不耗能

耗能的主动过程，有新蛋白合成

4.形态变化

细胞结构全面溶解、破坏、

细胞肿胀

胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体

5.DNA电泳

弥散性降解，

电泳呈均一DNA片状

DNA片段化（180-120bp）,

电泳呈“梯”状条带

6.炎症反应

溶酶体破裂，局部炎症反应

溶酶体相对完整，局部无炎症反应

7.凋亡小体

无

有

8.基因调控

无

有

4.是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。

——细胞凋亡不足

这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等发病有关。

——细胞凋亡过度

5.细胞凋亡的过程：

凋亡信号转导、凋亡基因激活、细胞凋亡的执行、凋亡细胞的清除

6.细胞凋亡的生化改变：

⑴DNA的片段化“梯”状条带

⑵内源性核酸内切酶激活及其作用

⑶凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用

⑴DNA的片段化“梯”状条带为细胞凋亡主要特征

①几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂解，导致DNA的断裂；

②DNA降解过程的特异性：

不伴有组蛋白和其它核蛋白的降解；

③染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞和形态改变的基础；

④DNAfragmentation是凋亡的“goldenmarker”。

⑵内源性核酸内切酶激活及其作用

由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质DNA切割

⑶Caspase9激活，需要通过CARD（caspase-recruitmentdomain）、Apaf-1、细胞色素c、

ATP等多个因子的参与Caspases在凋亡中的主要作用

①灭活细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）；

②水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体（apoposisboby）；

③在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能

7.细胞凋亡的调控

⑴细胞凋亡的诱导因素

①生理活性因子：

TNF家族（Fas-L,TNF）、TGF、神经递质（谷氨酸、多巴胺）、生长因子撤退、GC等

②损伤相关因子：

热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等

③化疗药物④毒素：

乙醇、β-淀粉样肽

⑵细胞凋亡的抑制因素

①凋亡相关基因的抑制作用：

p53、bcl-2、bcl-XL等。

②生理性抑制剂：

生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等

③病毒基因：

腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV、BHRF1等

④药物：

Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂（PMA）等

⑶凋亡信号转导系统特点：

①多样性：

不同种类的细胞系统不同

②偶联性：

与增殖分化的信号系统交叉偶联

③同一性：

多因素，共用同一系统触发

④多途性：

同一诱导因素启动多条信号转导途径

⑷细胞凋亡相关基因

①抑制凋亡基因：

bcl-2；②促进凋亡基因：

fas，P53；③双向调控基因：

c-myc，bclx

8.c-myc诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡。

当生长因子存在，bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。

bcl-2一类是抗凋亡的，另一类是促进凋亡的。

抗凋亡机制：

①直接的抗氧化；②抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质；③抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用；④抑制Caspases激活；⑤维持细胞钙稳态。

fas又称作APO-1或CD95，属TNF受体和NGF受体家族。

对细胞凋亡有促进作用。

基因产物为45KD的跨膜蛋白。

Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。

ICE蛋白酶家族，又称Caspases。

启动子Caspases：

Caspases8、9和10；

效应子Caspases：

Caspases3、6、7

p53，野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能——“分子警察”。

9.细胞凋亡发生机制：

⑴氧化损伤：

形成严重的氧化应激状态⑵钙稳态失衡⑶线粒体损伤

10.细胞凋亡的生物学意义

⑴发育从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。

⑵免疫系统淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终伴随着细胞凋亡。

⑶衰老细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。

⑷损伤与修复

⑸肿瘤发生细胞增殖与死亡的速度平衡失调。

⑹病毒致病病毒表达抗凋亡蛋白。

11.神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：

避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇到致转化刺激信号时。

如向终末分化的细胞中转染oncogene可引起细胞凋亡，而非增殖。

12.HIV-1感染后可引起CD4+T淋巴细胞的凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体gp120介导。

AIDS患者外周血淋巴细胞Fas/Apo水平明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。

由此，通过控制凋亡过程是否可以预防或延缓AIDS的进展。

13.细胞凋亡不足与过度并存：

动脉粥样硬化即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足。

14.合理利用凋亡：

促凋亡：

局部肿瘤热疗；高温43℃、30min

15.细胞凋亡的检测方法：

①细胞凋亡的形态学检测、②磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）、③线粒体膜势能（ψ∆mt）的检测、④DNA片断化检测、⑤TUNEL法、⑥Caspase-3活性的检测、⑦WB检测、⑧凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析

16.细胞凋亡的形态学检测

⑴光学显微镜和倒置显微镜：

未染色细胞：

凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

染色细胞：

常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。

⑵荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜：

一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：

HO，Hoechst33342；HO，Hoechst33258；DAPI。

⑶电子显微镜观察：

电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。

细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

17.磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）：

磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

18.线粒体膜势能（ψ∆mt）的检测：

线粒体荧光染料：

Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

19.DNA片段化分析：

细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂