方法学评价与试剂盒评价.docx
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方法学评价与试剂盒评价
第六章方法学评价与试剂盒评价实验
临床生化方法学评价与试剂盒质量评价是通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分析性能的重要手段。
通过评价实验的教学，在让学生正确掌握方法学评价和试剂盒评价实验的设计原理和基本方法，增强方法优选意识，为正确选择、评价和改进临床生化方法及其试剂盒，培养学生具有初步科研的能力，开拓创新等方面打好坚实的基础具有重要意义。
本章选用血糖测定项目，评价方法为葡萄糖氧化酶法（GOD-POD法）及其试剂盒，比较方法采用血糖测定的参考方法已糖激酶法（HK法）。
目前，两法均有试剂盒供应临床使用。
第一节方法学评价试验
GOD-POD法和HK法在方法学上的最大差异在于两者测血糖的特异性不同。
GOD-POD法第一步反应相当特异，GOD仅作用于β-D葡萄糖，此时如果用氧电极来测定氧的消耗速率，此法第一步反应即完成，特异性很高，但目前为临床方便常将过氧化物酶（POD）与之相偶联，测定GOD氧化葡萄糖生成的H2O2，此法存在两个问题：
①由于POD特异性较差，可作用于血中其它过氧化物，使结果偏高；②H2O2是强氧化剂，标本中共存的维生素C、尿酸等能使其还原，干扰测定结果，尤其在临床用药和高尿酸血症时特别敏感。
HK法的第一步反应由于HK特异性较低，不仅作用于葡萄糖，也作用于其它单糖生成相应的6-磷酸衍生物，但与它相偶联的指示酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）是特异性很高的酶，和其它单糖-6-磷酸无作用，仅选择性地作用葡萄糖6-磷酸（G-6-P），结果十分准确。
由此可见，HK法优于GOD-POD法，HK法被国际公认为参考方法，GOD-POD法只能用作临床常规检测方法，评价方法和比较方法以及相应的试剂盒组成见本章后附录。
实验27线性范围试验
在光谱分析中，测定该实验条件下被测物质符合Beer定律的浓度范围（线性范围），是评价分析方法准确性和实用性的重要工作。
通过线性范围测定，选择线性段作为该方法的分析范围，直线上任何一点的待测物浓度与吸光度的比值均为一常数，其斜率tanθ都相等，即
tanθ=
，
此处的值
称为校正常数，可用于计算测定结果。
这样，可使具有临床意义的标本测定值都限定在此范围内，以保证测定结果的可靠。
线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。
这种偏离，按Beer定律现象来自两个方面：
一是溶液本身不符合Beer定律，这种现象叫做化学偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度与浓度之间不成线性，这种现象叫仪器偏离，如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件的变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。
因此，在做方法学线性范围评价实验时，良好的仪器性能是必须的。
【原理】使用不同浓度的葡萄糖标准溶液，用GOD-POD法试剂测定各自的吸光度，以标准浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，在方格纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线（dose-responescurve）。
一般测定方法的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。
【试剂】
1．40mmol/L葡萄糖标准溶液称取已干燥恒重的无水葡萄糖0.7208g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。
2h后方可应用。
2．其它试剂同GOD-POD法试剂。
【操作步骤】
按表6-1操作
表6-1血糖与GOD-POD试剂剂量反应曲线的制作
加入物
标准管
0
1
2
3
4
5
葡萄糖标准液（μl）
0
2
4
6
8
10
蒸馏水（μl）
10
8
6
4
2
0
GOD-POD试剂（ml）
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
下同GOD-POD法，读取各管吸光度。
以葡萄糖浓度（mmol/L）为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，将其交点在方格纸上标出，即可获得血糖与GOD-POD试剂的剂量反应曲线。
【注意事项】
1．葡葡糖标准液的加量必须十分准确，应用计量性能准确度很高的微量进样器加样。
2．标准管系列中每管平行作3管取平均值。
3．本方法的线性可达22.24mmol/L，造成线性变窄的原因为试剂配制中组分投料不足；试剂配制后组分稳定性差；因运输、贮存不当等导致试剂组分的含量发生变化。
4．有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的高限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这往往是样品中的介质效应引起的，值得注意。
【线性范围的确定及其评价】
1．测定上限测定上限应使95%的临床标本不经稀释即可进行测定，具体数值必须通过线性范围试验加以确定，因为检测上限是不可超越的界限，当测定值高于上限临界值时，应减少标本用量或将标本稀释后重新测定。
2．测定下限测定下限实测多少就报告多少，如未经验证，随意延长测定下限的做法是不正确的。
3．对测定范围线性的评价通过制作剂量反应曲线的实验可以确定某种测定方法的吸光度－浓度线性范围，就能为制作实际工作中使用的校正曲线打下坚实的基础。
随后要对其线性拟合的良好程度和实用性进行实际检查与评价。
（1）对线性范围内的浓度与对应吸光度值作直线回归分析，求出此直线的截距a和斜率b，建立直线回归方程y=a+bx；并作相关分析，求出相关系数（r）。
值得强调的是校正曲线是一条直线，回归－相关分析只是一种数据评价手段，不能代替在基本操作上下功夫。
（2）线性回归方程拟合程度的检验：
所绘制的回归直线能否代表原资料各观测点的趋势，即各观测点与回归直线的差异是否只是来自随机抽样误差而无真正的差别，通过线性回归方程拟合度检验，即可作出判断。
方法仍然是用变异分析，看剩余平方和的大小，如剩余平方和（
）对
总变异（
）的比值越小，说明Y的实际观测值与Y的估计值（
）越接近，曲线拟合越好。
这种拟合度，可用相关指数（
）来表示。
越接近于1.0，表明拟合度越高。
这里要注意的是
必须由配得的回归方程直接算出的
值计算。
（3）使用高浓度和低浓度临床标本若干份进行实际的线性检查，理想的情况是该方法的分析范围的最高浓度上限应能使95%的临床标本不经稀释均能得到正确的测定结果。
实验28批内重复性试验
方法学重复性试验的目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。
重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。
方法学评价重复性试验应由实验者作批内（或天内）及天间重复性试验。
考虑教学安排，本实验仅做批内重复性试验。
【原理】批内重复性试验是指在相同条件下（用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。
其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价GOD-POD法测血糖随机误差的大小。
【试剂】
1．标本采用血糖浓度约为6.7mmol/L的血清标本（收集无溶血、无脂浊、无肝炎病毒污染的人混合血清或动物血清）。
2．其它试剂同血糖测定评价方法（GOD-POD）。
【操作步骤】将血清标本用GOD-POD法作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。
【计算】
1．检验20次测定数据中的离群值如存在异常值时应剔除。
对小样本测定来讲，Grubbs检验方法概率意义明确，能给出严格的结果，是最合理的检验方法。
用Grubbs检验准则，检验离群值的统计学公式是：
G=
式中Xd为离群值；
为包括离群值在内的测定值的均数；S为包括离群值在内的测定值的标准差。
如果计算的G值大于系数表（表6-2）中相应显著水平的a和测定次数n时的临界值Ga.n，则将dx作为异常值弃舍，可按下述三种情况来处理：
（1）只有一个离群值的情况：
设有n个测定数（X1（2）如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数
的同一侧，例如X1、X2都是离群值，则首先检验最内侧的一个数据（X2），即通过检验G2来决定X2是否应该弃舍。
如果X2应该弃舍，X1自然应该弃舍。
如果X2不应舍去，则再检验X1，但在检验X1时，测定次数不应作为少了一次。
（3）如果离群值有两个或两个以上，而且又分布于均数两侧，例如X1和Xn都同属于离群值，则分别检验X1和Xn，是否应该舍去。
如有一个数据决定舍去，那么再检验另一个数据时，测定次数应该作为减少一次来处理，而且此时应该选择99%的置信水平。
2．按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数（
）、标准差（S）和变异系数（CV%）。
（1）批内均数＝
（2）批内标准差（Sw）=
式中Si2为5轮各次测定值的方差，即：
Si2=
（3）变异系数（CV%）＝
×100
首先计算出每轮测定值的均数、标准差（Si）及方差
、
、
、
，并将数值填入表6-3内。
再将5轮的
总和代入公式即可算出批内标准差Sw。
最后计算出变异系数（CV%）。
表6-2Grubbs检验临界值Ga.n
测定次数
显著性水平
测定次数
显著性水平
（n）
0.05
0.01
（n）
0.05
0.01
3
1.135
1.155
29
2.730
3.086
4
1.426
1.493
30
2.745
3.103
5
1.671
1.700
31
2.759
3.119
6
1.822
1.944
32
2.773
3.135
7
1.938
2.097
33
2.786
3.150
8
2.032
2.221
34
2.799
3.164
9
2.110
2.323
35
2.811
3.178
10
2.174
2.410
36
2.823
3.191
11
2.234
2.484
37
2.834
3.204
12
2.285
2.549
38
2.845
3.216
13
2.331
2.607
39
2.856
3.228
14
2.372
2.658
40
2.867
3.239
15
2.409
2.705
41
2.877
3.250
16
2.443
2.747
42
2.886
3.261
17
2.475
2.785
43
2.896
3.272
18
2.504
2.821
44
2.905
3.282
19
2.531
2.853
45
2.914
3.292
20
2.557
2.884
46
2.923
3.301
21
2.580
2.912
47
2.931
3.310
22
2.603
2.939
48
2.940
3.319
23
2.624
2.963
49
2.948
3.328
24
2.644
2.987
50
2.956
3.337
25
2.663
3.009
60
3.03
3.41
26
2.681
3.029
70
3.08
3.47
27
2.698
3.049
80
3.13
3.52
28
2.714
3.086
90
3.17
3.56
100
3.21
3.60
【评价标准】如试验求得的血清葡萄糖GOD-POD测定法的CV值＜WHO对中等实验室提出的OCV（±3%）标准，即表明实验条件的控制达到最佳条件，试验结果可按OCV%报告。
作为方法探讨实验，其变异系数应该＜OCV标准。
表6-3批内重复性试验的数据处理
测定批数
每轮测定次数（n）及测定值（Xi）
∑Xi
Si
1
2
3
4
1
2
3
4
5
合计
【注意事项】
1．为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应时间，准确读数。
2．计算批内标准差（Sw）时不可误用连续测定精密度的统计学公式。
S=
否则会使Sw的估计值明显偏低。
实验29回收试验
回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。
用于测定实验方法的比例系统误差。
这种误差常随分析物的浓度增加而增加，常因样品中其它物质与分析物竞争分析试剂并与之发生反应而引起。
【原理】回收试验是发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。
通过测定GOD-POD法测血糖的回收率，能较确切地判断该分析方法比例系统误差的有无或大小，可以对方法的准确性作出可靠评价。
【试剂】
1．血清标本收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用GOD-POD法测定求得血糖浓度，再用生理盐水稀释至2.2mmol/L的血糖浓度备用。
2．葡萄糖标准液（80mmol/L）。
3．生理盐水。
4．其它试剂同GOD-POD法测血糖。
【操作步骤】
1．样品制备
基础样品：
血清0.9ml+0.1ml生理盐水。
回收样品Ⅰ：
血清0.9ml＋0.01ml80mmol/L葡萄糖标准液＋0.09ml生理盐水。
回收样品Ⅱ：
血清0.9ml＋0.06ml80mmol/L葡萄糖标准液＋0.04ml生理盐水。
回收样品Ⅲ：
血清0.9ml＋0.09ml80mmol/L葡萄糖标准液＋0.01生理盐水。
2．血糖浓度测定按GOD-POD法测定各制备样品的血糖浓度，每份样品作双份检测，结果取平均值。
【计算】
1．加入浓度计算
加入浓度（mmol/L）=标准液浓度×
2．回收量计算
回收量＝回收样品测得值－基础样品测得值
3．回收率计算
回收率（%）=
×100
请将各计算结果填入表6-4内。
表6-4回收试验的数据处理
样品
测得浓度（mmol/L）
加入浓度（mmol/L）
回收浓度（mmol/L）
回收率（%）
基础样品
－
－
－
回收样品Ⅰ
回收样品Ⅱ
回收样品Ⅲ
平均回收率
【注意事项】
1．分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水为平2.8、6.7、8.9mmol/L。
2．纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的10%，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消失。
3．准确加量是最主要的技术关键。
【结果判断】一般检验方法要求回收率在95%～105%之间，最为理想的回收率应是100%。
实验30干扰试验
干扰试验用于测定某物质加到样品中产生的系统误差，干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而异。
干扰试验既用于检测某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。
【原理】干扰试验是测定特异性和干扰二者引起的误差。
在具体方法学评价实验中，首先要确定被试可疑物质是否引起误差；若能引起误差，再进一步探讨其误差的来源是因方法特异性差还是干扰，若加入的物质本身和分析试剂反应并产生读数，这是特异性差，若加入物质并不与分析试剂反应，但它改变了分析物和分析试剂间的反应，这是干扰。
本实验选用尿酸做GOD-POD法测血糖的干扰试验，尿酸可以和GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。
因此，尿酸对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。
【试剂】
1．血清标本取血糖浓度约6.7mmol/L的混合血清，要求同回收试验。
2．尿酸标准液（9.0mmol/L）称取碳酸锂（AR）90mg，溶解在40ml蒸馏水中，加热至60℃使其完全溶解。
精确称取尿酸（Mw168.11）1513mg溶解于热碳酸锂溶液中，冷却至室温，移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，贮存在棕色瓶中。
3．其它试剂同GOD-POD法测血糖。
【操作步骤】
1．样品制备
基础样品：
血清0.9ml＋蒸馏水0.1ml。
干扰样品Ⅰ：
血清0.9ml＋9.0mmol/L尿酸标准液0.05ml+蒸馏水0.05ml。
干扰样品Ⅱ：
血清0.9ml＋9.0mmol/L尿酸标准液0.1ml。
尿酸样品：
蒸馏水0.9ml＋9.0mmol/L尿酸标准液0.1ml。
2．血糖值测定取各样品按GOD-POD法操作。
【计算】
1．干扰物加入值计算
干扰物加入值＝干扰物溶液浓度×
2．干扰值计算
干扰值（mmol/L）＝干扰样品测定值－基础样品测定值
3．干扰率计算
干扰率（%）＝干扰值/基础值×100
计算结果请填入表6-5内。
表6-5干扰试验的数据处理
样品
葡萄糖测得值（mmol/L）
加入尿酸值（mmol/L）
干扰值（mmol/L）
干扰率（%）
基础样品
－
－
－
回收样品Ⅰ
回收样品Ⅱ
尿酸样品
【注意事项】
1．可疑干扰物浓度加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，有可能时应达到病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在0.42～0.9mmol/L之间。
2．凡可疑干扰物都应做，这里仅是举例示范。
3．无论是方法特异性差或是受干扰，都影响到测定结果的正确性，影响的程度与分析物的浓度无关，但与非分析物的量有关，所以产生的误差都是恒定系统误差，常以偏差Bias作为统计量。
Bias指所有测定值系统性的偏离真值，表示系统误差的大小。
在干扰试验中，偏差等于干扰样品测定值与基础样品测定值之差。
其它注意事项与回收试验相同。
【结果判断】Bias＜允许误差（EA）的临界值，表明由干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不产生不良影响，可被接受。
血糖2.8、6.7、8.9mmol/L时的EA为0.56mmol/L。
实验31方法比较试验
方法比较试验是用两种方法同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差值，以此来估计被评价方法在实际测定病人标本时可能引入的总系统误差的水平。
通常假定其中一方法测定结果是无分析误差（或分析误差的方向和大小是已知）的，则两方法间的误差是另一方法在实际使用时所具有的误差。
其实，任何方法都会或多或少地存在一定的实验误差。
很多推荐的参考方法经过严格评价后，根据不同误差水平被分成不同级别，这里统称为已知正确度方法。
这些方法若用来测定病人标本时，所引入的实验误差都属于可接受的低水平，因而是可靠的。
进行方法学评价试验时，以已知正确度的方法为准，它和被评价方法间的差异，可认为是在原来已知正确度方法具有的误差水平以外又增加的系统误差，是由引用的被评价方法产生的，因此可作为被评价方法的总系统误差。
【原理】方法比较试验是将候选方法与准确度已知的方法（如参考方法）作对比分析，以评价候选方法的准确度，是考核候选方法是否可被采用的重要试验。
方法比较试验是用于检测候选方法系统误差的大小包括恒定误差和比例误差，如对适当的数据进行分析，也可以提供误差的性质。
本实验以HK法测血糖的参考方法作对比来评价GOD-POD法测定血糖的总系统误差。
【试剂】同GOD-POD法和HK法测血糖试剂。
【操作步骤】
1．选择临床高低不同的血清标本40份。
2．将每份标本分别用两种方法各测定2次，并计算两法各自的测定结果。
【数据处理】
1．将对比试验数据作散点图，图中以x轴代表对比方法的测定值，y轴代表被评价方法的测定数据，在方格纸上作图应散布于整个测定范围之内。
散点图能够提供初步的印象。
如果所有测定值的对应点在直角坐标图中大致呈45°角的直线分布，提示被评价方法与对比方法的测定结果之间存在密切的相关关系；若呈明显的曲线分布，虽然在统计学上可按照非线性资料处理，但在这种情况下，候选方法被采用的可能性极小。
2．如果x、y之间呈直线关系,即可用经典的直线回归分析法作统计处理，其结果可以显示候选方法的测定结果有无系统误差存在（这种误差可分为三类，即恒定系统误差、比例系统误差和（或）兼有两种误差）。
直线回归方程
＝a＋bx
上式中
表示按回归方程求得的y值估计值,a为回归直线在y轴上的截距，代表恒定误差的大小；b为回归系数，即直线的斜率，代表比例误差的大小。
a和b的计算公式分别为
在评价一个候选方法时，最理想的情况是回归直线通过零点，呈45°角分布，这时a＝0，b（x/y比值）＝1.0，表明既无恒定误差，又无比例误差存在。
但x和y都会有随机误差，a和b只是估计值，是会有所波动的。
如果a≠0，b的数值稍偏离1.0，但只要这种偏离程度比较小（可以忽略不计），据经验判断这一候选方法可以被接受，就能适用于临床检验的常规分析。
假如要对回归系数b作出较严密的统计判断，就需要进一步作回归系数的显著性检验。
3．根据计算出的回归方程的a、b值，可以计算出候选方法系统误差（SE）的大小，并与不同医学决定水平（Xc）的允许误差（EA）作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。
SE的可接受性判断指标为：
│（a+bXC）－XC│血糖测定的XC＝2.8、6.7、8.9mmol/L时，Barnett提出的EA值为0.56mmol/L。
4．作相关分析在方法比较试验中，相关系数（r）可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。
相关系数（r）按下列公式计算：
r=
对求出的相关系数还应作相关系数的t检验。
相关系数（r）的t检验统计学公式是：
将依据方法比较试验的原始数据（x和y值）求得的相关系数r及例数（n）代入t检验的统计学公式，即可求出相应的tr值，再按照n-2的方法计算出自由度（v），查t值表求得t0.05（v）及t0.01（v）相应的t值，若tr>t0.05（v），P<0.05，说明实测的相关系数（r）与0之间差异显著，两种测定方法的测定结果之间存在相关关系；若tr>t0.01（v），P<0.01说明实测相关系数（r）与0之间有非常显著的差异，两种方法的测定值之间存在着高度相关关系。
在评价对比资料的相关系数时，还应该特别说明两点：
①对比资料的相关系数（r）并不能指明有无恒定误差和比例误差；②相关系数（r）值的大小依赖于待测物的浓度范围，即r值随病人标本浓度范围的增大而增大。
据此，有人提出，只有当r值≥0.99时，才表明对比试验所选择标本中待测物的浓度范围达到了足够的宽度。
因而建议依据r值大小来判断两种比较方法分析结果符合程度时应持谨慎态度。
5．方法比较试验的数据属于配对资料，因而可作配对资料的t检验，其统计学公式是：
差值标准差（Sd）＝
自由度（V）＝n
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