基因工程综合实验开题报告格式1.docx

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基因工程综合实验开题报告格式1

《基因工程综合实验》开题报告

项目名称：

基因工程菌中Taq聚合酶的提取及活性鉴定

DNA探针的标记与Southern杂交

学院：

生命科学学院

专业年级：

12生技2班

成员及学号：

陈光煜3125413118

　　任勇杰3125313131

　　　　　　　　　吴艺委3125413128

吴少烽3125413116

2015年4月12日

一、立题意义及国内外的研究现状与存在问题

实验二

TaqDNA聚合酶是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，最早于1976年首次从水生栖热菌中分离得到。

由于TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性，Saiki等于1988年将该酶成功地用于PCR技术。

Taq酶在PCR反应中所起的作用是利用其3′→5′聚合酶活性以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端；同时利用其5′→3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。

由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。

VentTMDNA多聚酶：

是美国NewEnglandBiolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcuslitoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。

它的一些酶学性质较TaqDNA聚合酶更为优越，它能耐100℃高温且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。

近年，经过基因改造的HotStartTaqDNA聚合酶，因其低温时酶没有活性，94℃-95℃加热后开始反应，从而抑制了低温条件下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的特异性，同时HotStartTaqDNA聚合酶能为PCR反应提供更高的产量及灵敏度、特异性，已逐渐成为PCR技术的主流。

不过，Taq聚合酶的缺点之一为催化DNA合成时的相对低保真性。

它缺乏3'→5'核酸外切酶的即时校正机制，出错率为1/9000。

实验三

探针标记：

目前作为探针的标记物有两大类:

一类是同位素,一类是非同位素

PCR标记方法是通过聚合酶链式反应,在Taq酶的作用下,将DIG-11-dUTP掺入到新合成的DNA链中,适用于100bp～10kb的DNA探针的标记：

PCR标记方法是目前较先进的标记方法,可用于制备高比活性的DNA探针,较其他标记方法而言,不但经济、快速,而且具有模板用量少（2～10ng）,纯度不高的模板也可用于标记的优点,需要优化的条件少,标记探针的灵敏度、产量都较高,因此被广泛应用于基因组Southern印迹,Northern印迹,文库筛选,斑点/狭缝印迹,原位杂交等。

随机引物标记，即本实验采用的同位素标记方法，是以六聚寡核苷酸为引物,待标记的DNA为模板,在DNA聚合酶Klenow片段作用下,将DIG-11-dUTP掺入到新合成的DNA链中,适用于100bp～2kb的DNA探针的标记。

随机引物标记法对模板纯度要求很高,而且所需模板量较大,耗时较长,制备后的探针需纯化后才可用于杂交分析,否则会造成较高的杂交背景。

随机引物法标记的探针不具备上述PCR标记法的优点。

Southern印迹杂交又称凝胶电泳压印杂交技术，是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

该技术是1975年,Southern印迹杂交（Southernblot）由英国人埃德温•迈勒•萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）创建。

具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。

一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：

一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。

印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。

利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。

当前，使用0.4molLNaOH溶液将琼脂糖凝胶上的DNA在变性的同时转移到尼龙膜上,晾干膜后无需固定就可以直接用于杂交。

预杂交液和杂交液选用Church缓冲系统,该缓冲系统中仅需10gLBSA作为封闭剂即可。

整个洗膜过程可简化为一种溶液、2～3次洗涤。

碱变性及转移后的尼龙膜,也可以用于地高辛（DIG）等非放射性检测系统,并可耐多轮杂交和洗脱。

本方法可适用于包括高等植物基因组在内的多种生物材料的DNA检测。

Southern印迹杂交最大的不足是操作程序繁琐,对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求,要获得理想杂交结果需要反复摸索。

二、本课题的主要研究内容和方法、步骤、预期结果

实验二

主要研究内容：

TaqDNA聚合酶的提取及活性鉴定

方法：

透析袋处理提纯、SDS-PAGE检测提取纯化的TaqDNA聚合酶纯度

步骤：

（一）活化和诱导

（1）划线分离，37℃过夜

（2）挑取单菌落接种到适量LB培养基的试管中（含60～80μg/mL氨苄青霉素AMP100），37℃振荡培养过夜。

（3）以1:

100（v/v）的比例转接到同样的培养基中，37℃、200r/min继续培养到OD600值约为0.8～1.0（对数中期，大约6.5~7.5h）

（4）加入IPTG至终浓度为2.0mmol/L，继续振荡培养，诱导12h。

（二）重组TaqDNA聚合酶的提取和纯化

收集菌体（3500g离心10min）

↓

每40mL菌液离心后加入4mL洗脱缓冲液，重悬（加入比例10:

1）

↓

3500g离心3min重新收集菌体

↓

加入2mL预裂解缓冲液，重悬，室温放置15min（20:

1）

↓

加入2mL裂解缓冲液（现配现用），75℃孵育1h（20:

1）

↓

然后将裂解混合液转移到离心管，4℃15000g离心15min~20min

↓

转移上清至新的离心管中，加入1.2g硫酸铵（每毫升上清液加0.3g，终浓度30%），室温迅速混匀，4℃静置过夜（有文献说室温放置更佳）

↓

15000g离心15min~20min，将蛋白沉淀物重新悬浮至800μL洗脱缓冲液（50:

1）

↓

在储存透析液（现配现用）中透析（需前处理）至少12h。

透析后，用储存缓冲液1:

1稀释，储存于-20℃

（三）TaqDNA聚合酶的活性PCR测定

以提取的TaqDNA聚合酶和商品TaqDNA聚合酶分别进行PCR扩增（PCR体系和条件见实验“目的基因PCR扩增产物的克隆”），比较扩增效果，并拍照。

（四）TaqDNA聚合酶的分子量及纯度检测

以商品TaqDNA聚合酶为对照，用4%浓缩胶和12%分离胶的十二脘基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测提取纯化的TaqDNA聚合酶的纯度，各取20μL加入等量的2×上样缓冲液，100℃加热3min，冷却后即可上样，同时将低分子量蛋白标准品作平行处理。

预期结果：

①提取的TaqDNA聚合酶和商品TaqDNA聚合酶分别进行PCR扩增，扩增效果无明显差异。

②提取的TaqDNA聚合酶通过十二脘基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳跑出来的条带与商品酶的结果无明显差异。

实验三

主要研究内容：

DNA探针的标记与Southern杂交

方法：

放射性同位素标记DNA探针、Southern杂交

步骤：

一、放射性同位素标记DNA探针（随机引物标记）

在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动DNA的合成。

如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的随机序列（如6碱基引物则有46=4096种），可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，四种核苷酸底物中有一种是用同位素标记的，因而可产生均匀一致高比活放射性探针。

同位素标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比，Theklenowfragment去除了E.coliDNApolymeraseI的5'→3'的外切酶活性，具有5'→3'的聚合酶活性及3'→5'外切酶活性。

二、Southern杂交（PCR-Southern杂交）

（一）探针模板的制备

利用PCR方法对杂交目的基因进行PCR扩增，并回收PCR产物，以供探针制备和杂交。

注意：

PCR时应多做几管，以便增加PCR产物的回收量。

（二）探针的制备

（1）向一个反应管仲中加入1μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μL。

（2）沸水浴10min以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。

注意：

完全变性对于标记的有效性是十分重要的。

（3）充分混合DIG-HighPrime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心，37℃孵育1小时或者过夜。

注意：

较长的孵育时间（最高达20h）能够提高地高辛标记DNA的产量。

（4）加入2μL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65℃加热10min终止反应。

（三）转膜和固定

（1）选取有代表性的植物基因，进行PCR特异扩增，然后将PCR产物点样于浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上，在3V/cm的电压下电泳1h。

（2）电泳完毕后，将凝胶用ddH2O漂洗两次，用锋利刀片切去凝胶多余的部分，并在凝胶左上角切去一角作为标记。

（3）将凝胶转入数倍体积的变性液中，温和摇动45min，使DNA变性。

（4）将凝胶转入去离子水中漂洗片刻，转入中和液室温温和振荡5min使之中和，更换中和液再浸泡15min。

（5）浸泡的同时，准备一块长和宽均大于凝胶的玻璃板，上面用滤纸覆盖，充当吸液灯芯。

将盖有滤纸的玻璃置于一塑料盒上（宽于玻璃板），内注入足量2×SSC溶液，液面略低于玻璃板，待滤纸充分浸湿后用玻棒赶尽气泡。

（6）用刀片裁一张硝酸纤维素滤膜，长和宽分别比凝胶大1mm。

随后将裁好的滤膜用去离子水彻底浸湿，剪去一角后在2×SSC溶液中浸泡15~20min。

（7）从中和液中取出凝胶，翻转以使其背面向上，后放于玻璃板上滤纸的中央位置，赶尽气泡，并用parafilm膜封住凝胶边缘，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸层中。

（8）在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。

滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘，用玻棒赶尽滤膜与凝胶间的气泡。

（9）用2×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的滤纸，放于硝酸纤维素滤膜上方，用玻棒赶尽气泡。

（10）切一叠（5~8cm高）略小于滤纸的上方，上部放置玻璃板和重物。

转移8~24h，其间及时更换滤纸并补充2×SSC溶液。

（11）转移结束后，去除滤纸，翻转凝胶和滤膜，经凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用铅笔轻轻地在滤膜上标记加样孔的位置。

然后将滤膜在6×SSC溶液中于室温浸泡5min，然后将其置于一滤纸上于室温晾干30min以上，随后在80℃烘烤30min~2h，然后将滤膜用两层滤纸包好放于2~8℃下备用。

（四）分子杂交

（1）配制预杂交液，每平方厘米硝酸纤维素膜约需预交液0.2ml。

（2）将含有靶DNA的硝酸纤维素膜漂浮于6×SSC液面上使由上而下完全湿润后，使滤膜在液体内浸泡2min。

（3）将滤膜封入杂交袋，留一小口，按照每平方厘米硝酸纤维素膜加入0.2ml预交液，赶尽气泡后，严密封口，外面再套一个杂交袋后放入恒温水浴摇床中，42℃轻轻摇动，预杂交30min或过夜。

（4）预杂交的同时，68℃预热杂交液，并按20~25ng/ml取出5ul探针于沸水浴中变性5min，然后迅速置于冰上冷却3min，加入到预热好的杂交液中。

（5）将预杂交液倒掉，迅速向袋中加入预热的杂交液（含标记探针），赶尽气泡后封好，再套一个杂交袋并封口后于42℃杂交过夜。

（6）取出滤膜，于滤膜漂洗缓冲液Ⅰ中漂洗2×5min。

（7）取出滤膜，于经65~68℃预热的滤膜漂洗缓冲液Ⅱ中漂洗2×15min同时于65~68℃不断搅动。

（五）免疫检测

杂交和严谨洗涤后，将膜简单的用洗涤缓冲液冲洗1-5min；

在100mL封阻液中孵育30min；

在20mL抗体溶液中孵育30min；

用100mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min；

在20mL检测缓冲液中平衡2-5min；

将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上（或者杂交袋），向膜上加入2mL的新鲜配制的底物显色液。

均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。

保持膜静止，避光。

15-25℃中孵育到有颜色出现为止；

三、研究工作时间安排及具体进度

周一（5.4）：

进行实验二前的各项准备工作，配制LB培养基、洗脱缓冲液（4℃）、裂解缓冲液、储存缓冲液、储存透析液；将Tris-HCl（pH7.9）0.5mol/L、EDTA0.5mol/L、KCl1mol/L、甘油、无菌水高压灭菌；将IPTG100mmol/L；DTT0.648mol/L；AMP100mmol/L；过滤除菌，-20℃保存；并进行透析袋使用前处理；活化和诱导：

（1）划线分离，37℃过夜

（2）挑取单菌落接种到适量LB培养基的试管中（含60～80μg/mL氨苄青霉素AMP100），37℃振荡培养过夜。

（3）以1:

100（v/v）的比例转接到同样的培养基中，37℃、200r/min继续培养到OD600值约为0.8～1.0（对数中期，大约6.5~7.5h）（4）加入IPTG至终浓度为2.0mmol/L，继续振荡培养，诱导12h。

周二（5.5）：

进行重组TaqDNA聚合酶的提取和纯化：

收集菌体（3500g离心10min）→每40mL菌液离心后加入4mL洗脱缓冲液，重悬（加入比例10:

1）→3500g离心3min重新收集菌体→加入2mL预裂解缓冲液，重悬，室温放置15min（20:

1）→加入2mL裂解缓冲液（现配现用），75℃孵育1h（20:

1）→然后将裂解混合液转移到离心管，4℃15000g离心15min~20min→转移上清至新的离心管中，加入1.2g硫酸铵（每毫升上清液加0.3g，终浓度30%），室温迅速混匀，4℃静置过夜→15000g离心15min~20min，将蛋白沉淀物重新悬浮至800μL洗脱缓冲液（50:

1）→在储存透析液（现配现用）中透析（需前处理）至少12h。

透析后，用储存缓冲液1:

1稀释，储存于-20℃

周三（5.6）下午：

进行TaqDNA聚合酶的活性PCR测定：

以提取的TaqDNA聚合酶和商品TaqDNA聚合酶分别进行PCR扩增，比较扩增效果，并拍照。

同时进行TaqDNA聚合酶的分子量及纯度检测：

以商品TaqDNA聚合酶为对照，用4%浓缩胶和12%分离胶的十二脘基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测提取纯化的TaqDNA聚合酶的纯度，各取20μL加入等量的2×上样缓冲液，100℃加热3min，冷却后即可上样，同时将低分子量蛋白标准品作平行处理。

周六（5.9）上午：

配制实验所需溶液，有母液、转膜和固定所需工作液、杂交工作溶液、免疫检测工作液。

周六（5.9）下午：

进行探针模板的制备（利用PCR方法）、探针的制备（过夜孵育）

周日（5.10）：

进行转膜（转移8h）以及固定（烘烤30min），以及部分的分子杂交（预杂交30min，杂交过夜。

周一（5.11）：

进行分子杂交剩余步骤，以及进行免疫检测（显色）。

四、预期所需药品和仪器名称及数量清单

实验二

旋涡混合器，移液枪，枪头，1.5ml微量离心管，40或50ml离心管，双面离心管架，台式冷冻离心机，紫外分光光度剂，水浴锅，制冰机，PH计，恒温摇床，磁力搅拌器，电泳仪，梳子等，摇菌试管，三角烧瓶，烧杯，针筒，滤头，培养皿，试剂瓶。

[实验材料]

（1）菌种：

含TaqDNA聚合酶基因的E.coli工程菌

（2）酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，AMP（氨苄青霉素），葡萄糖，EDTA（乙二胺四乙酸），Tris（三羟甲基氨基甲烷），溶菌酶，盐酸，氯化钾，PMSF（苯甲基磺酰氟），吐温–20，NP-40（乙基苯基聚乙二醇），DTT（二硫苏糖醇），甘油，IPTG，无水酒精。

实验三

尼龙膜，DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI

[实验材料]

1.杂交母液的配制

（1）5MNaCl：

称取292.2gNaCl溶于800mlddH2O中，定容至1L，高压灭菌。

（2）10MNaOH：

称取80gNaOH溶于140mlddH2O中，定容于200ml。

（3）20×SSC：

称取175.3gNaCl、88.2g柠檬酸钠溶于800mlddH2O中，用10M的NaOH调pH7.0，定容至1L。

（4）1MTris-HCl：

称取121.1gTris加入800mlddH2O中，边搅拌边加入40ml浓HCl，最后用稀HCl调pH8.0，定容至1L，高压灭菌。

（5）1M马来酸：

称取23.2g马来酸溶于200mlddH2O中，高压灭菌。

（6）10%SDS：

称取10gSDS溶于100mlddH2O中。

（7）0.5MEDTA：

称取29.22gEDTA溶于100mlddH2O中调pH8.0，定容至200ml，高压灭菌。

2．转膜和固定所需工作液

（1）变性液（1.5MNaCl，0.5MNaOH）：

500mlddH2O中加入300ml5MNaCl和50ml10NaOH，定容至1L即可。

（2）中和液（1MTris-HClpH7.4，1.5MnaCl）：

400mlddH2O加入300ml5MNaCl，称取121.1gTris，边搅拌加加入40ml浓HCl，最后稀HCl调pH7.4，定容至1L，高压灭菌。

（3）2×SSC：

将20×SSC按照1:

10稀释即可，定容至1L，高压灭菌。

（4）6×SSC：

取300ml20×SSC稀释至1L，高压灭菌。

（5）0.2MEDTA：

取40ml0.5MEDTA稀释至100ml，高压灭菌。

（6）滤膜漂洗缓冲液Ⅰ（2×SSC,0.1%SDS）：

在800mlddH2O中加入100ml20×SSC和10ml10%SDS，定容至1L，高压灭菌。

（7）滤膜漂洗缓冲液Ⅱ（0.5×SSC，0.1%SDS）：

在800mlddH2O中加入25ml20×SSC和10mlSDS，定容至1L，高压灭菌。

3．杂交工作溶液的制备

预杂交液：

分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后立即在37℃条件下搅拌5min进行溶解。

杂交液：

预杂交液和探针混合。

4．免疫检测工作液的制备

洗涤缓冲液、马来酸缓冲液、检测缓冲液、TE缓冲液、封阻溶液、抗体溶液、底物显色液

五、指导教师意见