猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救.docx

猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救.docx

《猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救.docx（71页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救

密级：

论文编号：

中国农业科学院

学位论文

猪嵴病毒全长cDNA感染性克隆的构建及拯救

ConstructionandrescueofPorcineKobuvirusfull-lengthcDNAinfectiousclone

硕士研究生：

李长龙

指导教师：

冯力研究员

申请学位类别：

农学硕士

专　　　　　业：

预防兽医学

研　究　方　向：

兽医微生物及分子生物学

培　养　单　位：

哈尔滨兽医研究所

中国农业科学院研究生院

2014年5月

Secrecy:

No.

ChineseAcademyofAgriculturalSciences

MasterDissertation

ConstructionandrescueofPorcineKobuvirusfull-lengthcDNAinfectiousclone

Ms.Candidate：

LiChanglong

Advisor：

Prof.FengLi

Major：

PreventiveVeterinaryMedicine

Specialty：

MolecularBiologyandVeterinaryMicrobiology

May2014

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：

时间：

年月日

关于论文使用授权的声明

本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：

中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）

论文作者签名：

时间：

年月日

导师签名：

时间：

年月日

中国农业科学院

硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表

论文题目

论文作者

专业

研究方向

指导教师

培养单位（研究所、中心）

姓名

职称

单位

专业

签名

评

阅

人

答辩

主席

答

辩

委

员

会议记录（秘书）

论文答辩时间地点

摘　要

猪嵴病毒（PorcineKobuvirus，PKV）是小RNA病毒科嵴病毒属成员，是近年在腹泻猪体内发现的新型病毒。

同属成员还有爱知病毒（Aichivirus，AiV）和牛嵴病毒（Bovinekobuvirus，BKV），目前，爱知病毒和牛嵴病毒都已成功分离，而猪嵴病毒尚没有成功分离的报道。

近年来我国大部分地区规模化猪场暴发仔猪腹泻，导致仔猪大量死亡，造成严重的经济损失。

研究人员推测这可能与新发现的小RNA病毒如猪嵴病毒等有关。

有研究表明，猪嵴病毒在在腹泻猪和健康猪群内广泛存在，猪群感染率非常高，而且有研究表明猪嵴病毒感染很可能与猪腹泻有关。

获得纯化的病毒是研究其致病性及其理化特征的基础，由于猪嵴病毒尚不能成功分离，本研究采用反向遗传操作技术，在获得病毒全基因组序列的基础上，人工构建出囊括PKV全基因组的全长cDNA感染性克隆，通过转染特定细胞系，人工拯救出完整的PKV病毒。

为便于在蛋白水平上检测PKV，我们表达PKV-DX株的VP3结构蛋白，免疫Balb/c小鼠，通过常规杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌抗VP3结构蛋白的杂交瘤细胞，为下游PKV拯救病毒的鉴定及深入研究奠定了基础。

通过分析本实验室测得的PKV-DX株全基因组序列及pBeloBAC11载体、CMV启动子、HDV-BGH终止元件的序列，选择合适的酶切位点将PKV全基因组进行分段，同时设计引物引入无意突变分子标签。

使用高保真酶从病料中扩增出囊括PKV基因组的各片段，依次插入含有CMV启动子、HDV-BGH终止元件的pBeloBAC11载体，构建出PKV全长质粒命名为pBAC-PKV-DX。

全长质粒转染293T细胞，72h后通过RT-PCR、IFA、WB和电镜等技术对拯救病毒进行验证。

结果表明，PKV成功实现了人工拯救。

在全基因组序列比对中发现PKV2B区在不同基因组中存在缺失现象，而DX株为基因缺失株。

为探究2B区域缺失对病毒拯救的影响，在原有质粒pBAC-PKV-DX的基础上，人工合成PKVXM株2B区域不缺失的部分，构建不缺失的重组质粒pBAC-PKV-2B，转染293T细胞，72h后进行鉴定。

结果表明，2B区域缺失与否对病毒拯救没有影响。

本研究构建了两个囊括PKV-DX株全基因组的全长质粒，在此基础上实现了对PKV的人工拯救。

建立了PKV基因组的操作平台，为PKV的后续研究打下基础。

关键词：

猪嵴病毒；反向遗传系统；感染性克隆；仔猪腹泻

Abstract

PorcineKobuvirus（PKV）isanewmemberofkobuvirus,Picornavirusfamilyanditisnewvirusfoundinthediarrheapigsinrecentyears.Aichivirus（AiV）andBovinekobuvirus（BKV）arebothmembersofkobuvirusandhavebeensuccessfullyseparated,whilenoreportindicatedthatPKVhasbeenseparated.

Duringrecentyears,manylarge-scalepigfarmsinmostpartsofChinaencounteredtheoutbreakofpigletsepidemicdiarrhea,whichcausingmassivedeathpigletsandseriouseconomiclosses.Theresearchersspeculatedthatitmayberelatedtothenewemergeofpigintestinalvirussuchasporcinekobuvirus.Researchhasshownthatporcinekobuvirusiswidespreadindiarrheaandhealthypigs,andtheporcinekobuvirusinfectionassociatedwithswinediarrhea.Asporcinekobuviruscannotbesuccessfullyseparatedandthepurifiedvirusisthebasisofstudythepathogenicanditsphysicalandchemicalcharacteristics,wedecidetousereversegeneticstechnologyoperation,onthebaseofthePKVgenomesequence,constructthePKVgenome-widecDNAinfectiouscloneartificiallyandsavePKVbytransfectingspecialcellline.

Fordetectionofporcinekobuvirusprotein,weexpressVP3structureproteinofPKV-DXstrain,immuneBalb/cmiceandobtainahybridomawhichcansecretemonoclonalantibodyagainstVP3throughroutinehybridomatechnology.Laidasolidfoundationfortheidentificationanddepth-studyofPKV.

DependonthesequenceofPKV-DXstrainandpBeloBAC11vector,CMVpromoterandHDV-BGHstopelement,weselectedtheappropriateenzymesitestoseparatethePKVgenome.Thenwedesignedprimerstointroducenonsensemutationsasmoleculartag.WeamplifiedfragmentsofPKVgenomeandinsectinthepBeloBAC11vectorincludinngCMVpromoterandHDV-BGHstopelementtoconstructthefull-lengthplasmidnamedpBAC-PKV-DX.Thefull-lengthplasmidwastransfectedinto293TcellanddetectedtherescuePKVbyRT-PCR,IFA,WBandelectronmicroscopeafter72htransfection.TheresultsindicatedthatthePKVwassuccessfullyrescued.

Genedeletionin2BgeneofPKVwasfoundduringtheanalysisofPKVsequence.AsthePKV-DXstrainwasgenedeletionstrain,wedecidedtoexploretheinfluenceof2BgenedeletionforthePKVrescue.BasedontheplasmidpBAC-PKV-DX,weamplifiedthefullpartof2Bgeneandconstructthe2Bgeneno-deletionplasmidpBAC-PKV-2B.Aftertransfectionandidentification,theresultsindicatedthatthedeletionin2Bgenedon’thindertherescueofPKV.

Theresearchconstructedtwofull-lengthplasmidscontainingPKV-DXstraingenome,andrescuedPKVsuccessfully.Thefull-lengthPKVcDNAclonelaythefoundationforPKVfollow-upstudy.

Keywords:

PorcineKobuvirus;revesegeneticsystem;infectiousclone;pigletdiarrhea

目　录

第一章引　言1

1.1PKV概述1

1.1.1PKV的发现及命名1

1.1.2PKV生物学分类地位1

1.1.3PKV流行病学2

1.1.4PKV的诊断3

1.2PKV的基因组结构及功能3

1.2.1PKV的基因组结构3

1.2.2PKV各编码基因的功能4

1.2.3PKV的变异5

1.3BAC载体的简介与应用6

1.4本研究的目的与意义7

第二章PKVDX株全基因组序列的测定8

2.1材料与方法8

2.1.1样品8

2.1.2主要试剂与仪器8

2.1.3全基因组扩增引物设计8

2.1.4全基因组分段扩增及测序9

2.1.5全基因组序列的拼接与分析10

2.2结论11

2.2.1全基因组各片段的扩增11

2.2.2全基因组序列分析11

2.3讨论12

第三章PKVDX株VP3结构蛋白单克隆抗体的制备14

3.1材料与方法14

3.1.1病料、载体和感受态细胞14

3.1.2主要试剂与仪器14

3.1.3PKVVP3原核表达载体的构建、表达与纯化14

3.1.4MAbs的制备16

3.2结果17

3.2.1PKVVP3基因的扩增及重组质粒的鉴定17

3.2.2VP3蛋白的表达与纯化17

3.2.3重组VP3蛋白的免疫原性分析18

3.2.4VP3单抗的免疫活性分析18

3.2.5VP3单抗的亚类鉴定19

3.3讨论19

第四章PKVDX株BAC载体全长cDNA感染性克隆的构建21

4.1材料与方法21

4.1.1病料、载体和感受态细胞21

4.1.2主要试剂与仪器21

4.1.3限制性内切酶位点的选择21

4.1.4全基因组及各元件分段22

4.1.5PKVDX株全长质粒构建24

4.1.6PKV2B区完整毒株全长质粒的构建25

4.1.6PKVDX株的拯救26

4.1.7拯救病毒的RT-PCR鉴定26

4.1.8拯救病毒的遗传标记测序鉴定27

4.1.9拯救病毒的间接免疫荧光试验（IFA）鉴定27

4.1.10拯救病毒的VP3结构蛋白WesternBlot鉴定27

4.1.11拯救病毒的电镜鉴定28

4.2结论28

4.2.1PKVDX株全基因组各片段及CMV、HDV-BGH元件的扩增28

4.2.2K1、K2、K3片段的扩增28

4.2.3K1片段连接后的鉴定29

4.2.4K3片段的鉴定30

4.2.5K2片段的鉴定30

4.2.6拯救毒的RT-PCR鉴定31

4.2.7拯救病毒的遗传标记测序鉴定31

4.2.8拯救毒的间接免疫荧光（IFA）鉴定32

4.2.92B缺失与否对病毒拯救的影响32

4.2.10拯救毒的WesternBlot鉴定33

4.2.11拯救毒的电镜鉴定33

4.2.12PKV敏感细胞系的筛选34

4.3讨论34

第五章全文结论36

参考文献37

附　录42

致　谢49

作者简历50

英文缩略表

英文缩写

英文全称

中文名称

AiV

Aichivirus

爱知病毒

BKV

Bovinekobuvirus

牛嵴病毒

EILSA

Enzymelinkedimmunosorbentassay

酶联免疫吸附试验

IIF

Indirectimmunofluorescence

间接免疫荧光试验

MAb

Monoclonalantibody

单克隆抗体

ORF

Openreadingframe

开放阅读框

PBOV

Porcinebocavirus

猪博卡病的

PBS

Phosphate-bufferedsaline

磷酸盐缓冲液

PCR

Polymerasechainreaction

聚合酶链式反应

PEDV

Porcineepidemicdiarrheavirus

猪流行性腹泻病毒

PKV

Porcinekobuvirus

猪嵴病毒

PNoV

Porcinenorovirus

猪诺瓦克病毒

PoRV

PorcineRotavirus

猪轮状病毒

RT-PCR

Reversetranscription-polymerasechainreaction

反转录聚合酶链式反应

SDS-PAGE

SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

TGEV

Transmissiblegastroenteritisvirus

猪传染性胃肠炎病毒

UTR

Untranslatedregion

非翻译区

WB

WesternBlot

蛋白印迹

第一章引　言

猪嵴病毒（PorcineKobuvirus，PKV）是小RNA病毒科嵴病毒属成员，2007年第一次在匈牙利发现（Reuteretal.,2008），之后相继在中国、中国台湾、日本、韩国、美国、意大利和巴西等国家和地区被发现（Yuetal.,2009;Khamrinetal.,2009;Khamrinetal.,2010;Parketal.,2010;Vermaetal.,2013;Profioetal.,2013）。

PKV在腹泻仔猪和健康仔猪体内均检出过（Reuteretal.,2010），但有研究表明PKV与仔猪腹泻有关（Reuteretal.,2010）。

嵴病毒属目前有三个成员：

爱知病毒（Aichivirus，AiV），牛嵴病毒（Bovinekobuvirus，BKV）和猪嵴病毒（PorcineKobuvirus，PKV）。

猪嵴病毒于2013年2月份确定为嵴病毒属正式成员。

近年病毒界对嵴病毒属非常重视，研究表明，AiV可能引起人的严重腹泻，BKV可能引起牛的腹泻，PKV则可能与猪病毒性腹泻相关。

1.1PKV概述

1.1.1PKV的发现及命名

kobu一词源于日语，是“球形”或“突起”的意思，由于kobuvirus的病毒粒子在电镜下呈球形，故命名为嵴病毒。

人的爱知病毒（Aichivirus）是一种新型小RNA病毒，由YamashitaT等人于1997年首次从一位胃肠炎病人的粪便标本中分离到，由于该病人来自日本爱知县（Aichi）（Yamashitaetal.,1991;YamashitaTetal.,2014），爱知病毒的名称由此而来。

基因序列分析证实爱知病毒是一种小RNA病毒，跟去其基因型可分为A、B、C三种亚型，A、B亚型相似性较高，同源性可达90%（Yamashitaetal.,1991;Ambertetal.,2008）。

随后，与此类似的病毒从牛、猪、羊、蝙蝠、狗、猫、雪貂和狐狸中被发现（Yamashitaetal.,2000;Yamsshitaetal.,2003;Reuteretal.,2008;Yuetal.,2011;Reuteretal.,2010;Lietal.,2010;Lietal.,2011;Chungetal.,2013;Smitsetal.,2013;BullmanSetal.,2014；DiMartinoBetal.,2014;AmimoJOetal.,2014;FanSetal.,2014;ChungJYetal.,2014）。

关于嵴病毒结构蛋白的研究也不断深入（ChenLetal.,2014）。

嵴病毒还可能引起病毒血症，2003年在健康牛群的血清和粪便样品中均检测到BKV（U-1,AB084788）（Yamashitaetal.,1998;ChangJetal.,2014），目前已有日本、匈牙利、泰国、比利时和中国五个国家报道牛嵴病毒的存在（Mauroyetal.,2009）。

2007年，匈牙利的Reuter等人和和中国研究人员首次报道了PKV的发现，并对其全基因组进行了测序，发表了S-1-HUN和swine/2007/CHN两个毒株的全基因组序列，作为PKV的参考毒株。

1.1.2PKV生物学分类地位

1999年，嵴病毒属（kobuvirus）作为一个新的属被放在小RNA病毒科内。

2009年，国际病毒分类委员会第九次报告再次确定了kobuvirus的生物学分类地位（Yamashitaetal.,2003）。

在

2012年的国际病毒分类报告中，PKV开始被列为嵴病毒属的待定成员。

2013年2月，PKV正式成为嵴病毒属成员。

与嵴病毒同科的还有另外11个成员属：

口疮病毒属（Aphthovirus）、禽星状毒属（Avihepatovirus）、心病毒属（Cardiovirus）、肠病毒属（Enterovirus）、马鼻病毒属（Erbovirus）、戊肝病毒属（Hepatovirus）、双埃可病毒属（Parechovirus）、札幌病毒属（Sapelovirus）、西尼卡谷病毒属（Senecavirus）、捷申病毒属（Teschovirus）和禽脑脊髓炎病毒属（Tremovirus）（Fauquetetal.,2005）。

1.1.3PKV流行病学

国外PKV流行情况：

2008年，匈牙利首次从发生腹泻的哺乳期仔猪（10日龄）的粪便中检测出PKV，腹泻猪感染率达100%；2009年研究人员分别对不同日龄（10、20、90、180日龄）的仔猪进行检测，阳性率约为65%。

2009年，韩国也从发生腹泻的仔猪粪便样品中检测出了PKV，阳性率达36.1%，21日龄以前的仔猪阳性率为60%，育肥猪阳性率为19.2%。

2009年，日本研究人员从28个猪场中采集的293份粪便样品其PKV阳性率达45.4%，而6月龄以上育肥猪阳性率为20.5%,6月龄以下的猪阳性率可达49.8%。

研究人员还发现，PKV不仅可以感染肠道，也可以产生免疫逃避进入血液形成病毒血症，造成长期的隐形感染（Yangetal.,2009;KitajimaMetal.,2011）。

而且，经济欠发达地区的PKV等小RNA病毒检出率较高（NixWAetal.,2013;AlcaláAetal.,2010）,同一国家的不同地区检出率还有很大差异（RibeiroJetal.,2013）。

国内PKV流行情况：

2009年，Yu等人利用RT-PCR技术在检测杯状病毒的时候意外发现一条大小约为1000bp的非特异条带，将此条带测序进行序列分析发现与BKV3D基因部分很相似，核苷酸同源性可达73%，为进一步进行验证该结果，又重新设计了一条特异性引物，扩增目的片段为443bp，之后对322份15日龄以内的仔猪粪便样品进行检测，结果表明阳性率达30.12%（Yuetal.,2009）。

2010年从河南、湖南、湖北等省采集295份健康猪粪便和血清样品，其中粪便样品PKV阳性率达38%，而血清样品阳性率为6.5%。

2010年，研究人员对湖北省54个规模化养殖场的165份仔猪病料进行RT-PCR检测，其中腹泻仔猪的PKV阳性