磁性细胞分离磁迁离能力的表征.docx

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磁性细胞分离磁迁离能力的表征

Anal.Chem.2003,75,6868-6874

磁性细胞分离：

磁迁移能力的表征

KaraE.McCloskey,†,‡,§JeffreyJ.Chalmers,*,†andMaciejZborowski‡

DepartmentofChemicalEngineering,TheOhioStateUniversity,140W.19thAvenue,Columbus,Ohio43210,and

DepartmentofBiomedicalEngineering/ND-20,TheClevelandClinicFoundation,9500EuclidAvenue,

Cleveland,Ohio44195

摘要：

磁性细胞分离已经成为人们从非均相细胞群中富集和去除感兴趣的细胞的一种流行手段。

磁性细胞分离的一个重要的方面就是细胞结合顺磁性材料的能力。

正是顺磁性材料赋予靶细胞正向迁移能力，从而实现有效的细胞分离。

免疫磁性标记细胞的磁性标记和磁迁移能力之间的数学关联式被开发出来。

影响免疫磁性标记细胞的重要因素有四个：

细胞簇的抗体结合能力（ABC），第二抗体的放大系数（ψ）,粒子-磁场相互作用参数（ΔxVm），和细胞直径（Dc）。

这些参数的范围被计算出来，以及这些参数如何影响磁迁移能力的最大值和最小值被展示出来。

这些参数的详细理解使得对细胞磁迁移能力的预测和通过选择抗体和磁性粒子结合物控制细胞迁移能力成为可能。

细胞筛分在许多生物和生物医学应用（包括疾病的诊断和治疗）中是一种重要的细胞制备技术。

比如，从人类脐带血和流动周边血中稀有造血干细胞的分离可用作受过辐射和高剂量化疗的病人骨髓移植的替代品。

在成人周边血和脐带血中发现的内皮干细胞对于治疗康复是有着很大价值的。

磁性细胞分离已经成为从非均相混合物中筛分细胞，尤其是稀有细胞的一个普遍工具。

通常磁性细胞分离使用针对某种细胞表面的表位的抗体使之与磁性粒子结合物一起附加在靶细胞上（图1）。

磁性附加后的细胞的磁迁移能力的标度，是把这些细胞与未标记细胞、未附加细胞区别开来的参数。

更有效地讲，磁迁移能力是免疫磁性标记后的细胞在磁性能量梯度场中的速度相对于磁性能量梯度的微分。

速度是磁场力作用（实际上是磁力感受材料与所加的磁场能量梯度的相互作用）在细胞上的结果。

在大多数分离工艺中，靶细胞和掺杂细胞的物理化学参数的这种增加的差异使得分离效果变好。

图2展示了实验测定的非磁性和磁性粒子的磁迁移能力的例子。

显然，这两个细胞群的磁迁移能力模型的差异是非常显著的，从而在理论上看可以分得很清晰。

除去去氧血细胞（这种细胞含有高浓度顺磁性血红蛋白）和静磁细菌以外，所有其他细胞都只是轻微抗磁性的（他们的磁感受性为负值，从而导致在磁能量梯度相反的方向上一个非常小的速度）。

其结果是，经磁性标记的和未经磁性标记的磁性迁移能力的差异通常取决于磁性标记细胞自身的磁迁移能力的大小。

MiniMACS磁性分离系统（MiltenyiBiotech,BergischGladbach,Germany）是一个广泛使用的间歇式细胞分离装置。

尽管这种装置的目的是分离许多种抗原定义的细胞，它还是被证明其分离系统的操作效果取决于标记细胞群的磁迁移能力的大小。

相比较而言，非间歇式的连续流入式的免疫磁性细胞分选装置正在开发用于大量细胞的分离。

在连续免疫磁性细胞分离中，设计、操作和分离效率都要比间歇性分离严格地取决于细胞簇的磁迁移能力。

为了测量和研究免疫磁性标记细胞的磁迁移能力，一种细胞跟踪速度测量装置（CTV）被开发出来，在严格划分的磁能量梯度场中测量免疫磁性标记后的细胞（或粒子）的速度。

与这种仪器相配套的定义免疫磁性标记的细胞的磁迁移能力的数学关系式也已经被开发出来。

随着这种CTV装置的使用，这些关系式通过对许多免疫磁性标记的细胞的磁迁移能力的直接测量和校准微珠进行验证。

通过以上提到的这些研究，我们发现了影响免疫磁性标记后的细胞的磁迁移能力最主要的四种参数：

细胞簇的抗体结合能力（ABC），二阶抗体结合放大因子（ψ），磁性粒子-磁场相互作用参数（ΔxVm），和细胞直径（Dc）。

这篇论文对这些参数中的每一种如何影响免疫磁性标记细胞的磁迁移能力做了详细的分析论述。

来自以前研究中的原始数据被用在理论计算中，以得出在不同的磁性标记条件下可能出现的范围（即理论最大值）。

现在人们对影响顺磁性材料键合到细胞上的知识已足以让人们不仅能精确地估计细胞的磁迁移能力，而且通过抗体试剂和用免疫磁性标记后的磁性粒子复合物可以更好地控制细胞簇的磁迁移能力。

磁迁移能力模型.磁迁移性类似于在电泳和层析分离中碰到的相应的电迁移能力和层迁移能力。

对磁性分离来说，磁迁移能力完全取决于磁性粒子的本征性质和介质的内在特性，如介质黏度，粒子尺寸，以及介质和磁珠的磁感应特性。

对于一个顺磁性标记的细胞或微珠来说，通过液体悬浮体系决定它运动的力量是磁力（Fm）,浮力（Fbou）,重力（Fg）,和曳力（Fd）。

使用两步标记方案的免疫磁标记的细胞或微珠，作用在它表面的顺磁力可用下式表示：

Fm=（n1θ1λ1）（n2θ2λ2）n3Fb

（1）

下标“1”和“2”分别指代的是一阶和二阶标记抗体，n1是每个细胞的抗原结合位点数目，包括特异性和非特异性抗原位点（ns+nns）,θ1是粒子表面的抗原分子被第一抗体结合的百分率。

系数λ1代表第一抗体结合价态。

复合后的术语n1θ1λ1与通常使用的术语细胞簇的“抗体结合能力”（ABC）是等价的。

抗体结合能力是第一抗体结合在细胞上或微珠上的数目大小，这个值不仅包括每个细胞的抗原数目，而且包括一些可变量，如抗体结合价数，空间位阻，结合能力以及非特异性结合。

这些参数以同样的顺序影响第二抗体在第一抗体的位点上结合。

在这种情况下，n2是第一抗体上能被第二抗体识别的结合位点。

θ2是第一抗体上被第二抗体结合的位点占该二抗能够结合的全部位点的百分率。

λ2代表二抗结合价态。

术语n2θ2λ2然后被复合成一个整体相，ψ代表由于二抗在一抗上的多位点结合造成的抗体增值数，或是第二抗体在每一个一抗上结合的数目。

参数n3代表与抗体复合在一起的纳米磁性粒子数，在这种例子中，指的是与二抗复合。

综合参数ABC，ψ和n3成一个整体Nmp，这个值代表了与每一个细胞或每一个微珠键合的磁性纳米粒子数，因此被称作每个细胞或微珠的“磁性粒子结合能力”。

是沿着磁场梯度方向上作用在顺磁性粒子颗粒上的磁场力的大小，被表示成：

这里，μ0是指自由空间的磁场穿透能力，Δx是磁性材料的磁感应特性xb与环境介质的磁感应特性xf的差异。

Vm是每一个顺磁纳米粒子的顺磁性材料的体积，B是磁通量密度。

注意粒子-磁场相互作用参数ΔxVm是代表单个磁性纳米材料的磁特性的常数。

用来实验测量的磁迁移能力的CTV装置被固定方向，使得实验系统中的磁场能量梯度与重力相垂直，这样，其作用的力就变成磁场力Fm（其表示式如方程1）和曳力Fd（对缓慢移动的粒子来说它遵循Stokes定律）。

在水相介质中，微米尺寸的物体的运动是由粘性力决定的，相对于分离所需时间来说，它们仅需要极短的时间就可达到最大速度。

这导致磁场中在整个细胞运动路径中作用在该细胞上的磁场力和粘性曳力之间达到一个平衡态。

使这两种相对作用的作用力相等（也就是说，忽略粒子的惰性），我们得到一个磁性化后的细胞或微珠的磁能量梯度诱导速度的关系式：

这里Dc是细胞或微珠的直径，η是流体的黏度，f=3∏Dcη是运动细胞或微珠的摩擦系数。

磁迁移驱动力Sm与磁性能量梯度成正比，被定义为

磁迁移能力m被定义为

用磁迁移驱动力Sm去除速度值Vc就得到磁性标记后的细胞和微珠磁迁移能力m，m是类似于电泳仪动能力的一个标准化后的参数，

从方程6可以看出，免疫磁性标记后的细胞的磁迁移能力m是参数ABC，ψ,n3,ΔxVm,Dc和η的函数。

载体溶液的黏度η在人们感兴趣的范围内（通常在0℃-室温）其大小的变化是高度可预测的。

另一方面，每一个第二抗体结合的磁性颗粒的作用数目通常是1（或者某些情形下小于1）。

因此。

对于同样的温度和载体流体组成来说，对磁迁移能力影响最大的参数是ABC，ψ,ΔxVm,（图3）和Dc。

这篇文章的剩下部分将仔细探讨这些值的范围（包括理论值，和报道的实验值）

结果和讨论

抗体结合能力---ABC：

第一个要考察的参数是抗体结合能力ABC，它提供的是结合在单个细胞表面分子的抗体的定量信息。

这个术语反映了细胞表面的靶向抗原分子的表达程度，以及抗体使用的抗体结合机制，包括结合价态，空间位阻，特异性抗体的亲和力。

细胞的抗原的表达水平已经被证明有细胞分型的重要性，在一些例子中，被证明对于疾病的预测和诊断极有价值。

抗体结合能力ABC影响免疫磁性标记的细胞的磁迁移能力（方程式6），在那些靶向表抗原表达数较大的细胞中会显示出较大的ABC值，因而通常会显示出较大的磁迁移能力。

随着ABC的上升，一个细胞上结合的磁性材料的数量也上升，这种增加可在图3中得到清晰可见的剖析。

上面的隔栏与下面左边的隔间的图相比时，具有较大ABC值（由于具有更多的表面抗原）的细胞会导致结合在它上面的磁性粒子数也较大，接下来结合了较多磁性粒子数的细胞也具有较大的磁迁移能力。

这种理论上ABC与磁迁移能力呈直线性正比关系。

尽管图3描述的只是当ABC=3时，一个细胞簇的平均抗原表达，然而实际上每个细胞的ABC可在几百直到大于一百万范围内变动。

ABC与磁迁移能力之间只在有限的范围内保持线性关系，这是由于被结合磁性粒子的空间位阻。

尽管在高ABC值时，有大量的位点可供磁性粒子结合，然而可供磁性粒子键合的表面积是有限的，这是由于受到细胞直径和磁性粒子的尺寸。

由于这种限制，所以能够键合的磁性粒子的最大数值的理论估算在已进行过的计算中都是给定了某一种细胞和磁性粒子的大小。

免疫磁性粒子的尺寸范围在12nm（ferritin）到5μm（Dynabeads，DynalBiotech，Inc.,LakeSuccess,NY）这些计算都假设磁性小球都是紧密排列的六角形框架式刚性体堆积在一个刚性的球形的细胞表面。

图4是这些计算结果的作图，以每个细胞的磁性载体的数目（Nmp）做纵轴，磁性粒子的直径为X轴。

两种细胞的大小被假定为：

7μm（实线表示）和15μm（虚线）。

标注过的灰色区域代表是一些已经报道过的磁性粒子的直径范围，包括尺寸分布。

注意Dynabead的珠子是单分散性非常好的微球，它包括四个分布很宽的尺寸，1.05μm，2.8μm，4.5μm，5.0μm。

由于范围比较大，所以两个坐标轴都采用对数坐标。

注意能够结合在一个细胞上的数目在106附近变动，这取决于磁性粒子的大小，同样的磁珠结合在一个15μm细胞上的数目可能比一个7μm细胞上结合的数目多上10倍。

第二抗体键合扩增数ψ.在细胞的免疫荧光或免疫磁性标记过程中，通常使用一种两步抗体标记方案，第二抗体可能结合在第一抗体的许多抗原靶点上。

这包括以下这些：

（人，大鼠，小鼠，等等）的第一抗体，结合在第一抗体上的荧光染料（FITC，PE，等等），或是结合在第一抗体上的其他分子（如生物素），所有这些都会提供表位点。

除了能提供多种表位点以外，两步抗体标记方案也能扩增结合在细胞上的二抗数目，因为第一抗体提供了许多潜在的位点供第二抗体去结合。

如果磁性粒子被结合在第二抗体上，那么磁性粒子结合在细胞上的数目也同样会被扩增，这样增加了细胞的磁性迁移能力。

由于第二抗体结合在第一抗体上多个表位点而造成的磁性迁移能力的上升被称作“第二抗体结合扩增”（ψ）。

这种扩增效果通过比较图3中的上面的图与下面中间的那幅画就能看得很清楚。

第二抗体的结合扩增已经在以前被人仔细研究过，并且通过比较直接标记抗体-CD4MACS的磁性纳米粒子的淋巴细胞的磁迁移能力与用两种不同的间接抗体标记方案的同一种淋巴细胞的磁迁移能力而定量测定。

结果表明，anti-FITCMACS磁纳米粒子第二抗体结合在每一个第一CD4FITC抗体的平均扩增数为3.4，ψ=3.4±0.33，而当抗大鼠MACS磁性纳米粒子第二抗体结合在每一个第一大鼠CD4FITC抗体（这种抗体在CD4阳性的淋巴细胞上）时，结合扩增数近似为1，ψ=0.98±0.081。

为了进一步研究ψ对磁迁移能力，磁迁移能力与ABC的比值被计算出来，划分为三个等级的第二抗体扩增系数，或称ψ值（图5）。

这些计算中，假设ΔxVm,=2.5X10-16mm3（这是先前计算出来的MACS磁性纳米粒子的值），n3=1。

Ψ的值被选成在1（没有扩增）和4（根据以前的计算结果得来的值）。

Ψ=4的最大值非常有可能是一种空间位阻现象潜在地轻微增加了小磁性粒子的ψ值的结果。

在图5中，注意每一条直线的起始斜率是第二抗体扩增因子ψ值，细胞直径Dc的函数。

直线的斜率随着ψ值增加而增加，而且由于较大的细胞对应于较大的曳力，因此斜率又随着Dc的增加而减少。

也要注意的是水平饱和线，它对应于结合上磁性粒子的最大数，这样，对于一个给定的细胞尺寸和磁性纳米粒子尺寸（50nm）来说，可得到一个磁迁移能力的最大值。

这里我们能看出，若一个细胞的直径近似是另一个细胞的2倍的话，它的最大磁迁移能力也是那个细胞的2倍大。

粒子-磁场相互作用参数，ΔxVm,.粒子-磁场相互作用参数ΔxVm,是磁性粒子中磁性材料相对于流体载体的磁感应性Δx的差值和每个磁性粒子的磁性材料体积Vm,的乘积。

ΔxVm,值的大小取决于连接在抗体上的特异性磁性粒子，包括磁性粒子的大小（相对于磁性材料的体积Vm,而言），因为较大的磁性粒子和那些具有较大磁感应性的磁性粒子在细胞上能产生较大的力，从而导致更大的磁迁移能力的数值。

图3中将上层的右边的图相比较，我们可以看出，对大的磁性粒子来说（Vm,大）ΔxVm,值较大。

粒子-场相互作用参数也随着Δx增加（文中没有展示）。

尽管许多种类的磁性微珠或纳珠被用来标记和分离细胞，最常用的是单分散聚苯乙烯球添加铁修饰而成。

铁的氧化物通常包括一种r-Fe2O3和Fe3O4（磁铁石）的混合物。

Fe3O4的好处是在使用低磁场的情况下能达到高磁饱和饱和度。

Fe2O3的好处是在相当宽的范围内，其磁化是所施加的磁场强度的线性函数，因此在与顺磁、超顺磁和反磁相同的情况下，很易表征它的磁感应特性。

图6中的数据提供了3种不同的市场上可买到的铁氧化物磁性粒子的磁性迁移能力的估计值范围，MACS微珠[MitenyiBiotech,Auburn,CA],Immunicon铁流体[ImmuniconFerrofluids,HuntingdonValley,PA,现在可通过MolecularProbes公司（Eugene,OR.）购买到]，DynabeadsM-450（DynalBiotech,Inc.LakeSuccess,NY）。

MACS磁性纳米粒子的粒子-磁场相互作用参数的值ΔxVm,=2.5X10-16mm3,已经由实验中得到。

将MACS磁性纳米粒子的这个ΔxVm,值带入，可通过计算得到稍微大一些的Immunicon纳米粒子的ΔxVm,估计值为8.0X10-15mm3，粒径要大得多的Dynabeads的ΔxVm为5.0X10-11mm3。

这些估计值是使用磁性粒子尺寸与组成自动产生的估算值。

所使用的磁性粒子的平均直径为：

MACS纳米粒子50nm，Immunicon140nm，DynabeadsM-450为4.5μm。

这些粒子的相应的磁性材料的百分比约为：

MACS55%，Immunicon80%，DynabeadsM-45015%。

这些值在估计ΔxVm,时都有一个假设作为前提：

Immunicon，Dynabeads和MACS顺磁性纳米颗粒的组成r-Fe2O3和Fe3O4磁性材料比例是可以比较的。

注意：

对于结合在细胞上的相同数目的磁性粒子来说，Immunicon纳米磁性粒子引入的迁移能力几乎比MACS纳米粒子大2个数量级，而Dynabeads产生的细胞迁移力又要比较小的MACS纳米粒子大5个数量级。

细胞直径Dc.最后一个参数是细胞的直径Dc，尽管Dc不是一个可调节参数，但它可能以三种方式影响磁性迁移能力。

这些包括①作用在运动细胞上的曳力，②细胞的抗体结合能力ABC，③所结合磁性粒子的空间位阻。

第一个机制是曳力，Fd=fVc，也就是阻碍免疫标记后的细胞在粘性介质中以速度Vc运动的反作用力（遵从Stoke’sLaw）。

较大的细胞显示出较大的摩擦系数，f=3∏ηDc；这样，作用在较大细胞上的曳力较大，降低了细胞的磁迁移能力（见方程6）。

通过比较图5中的直线斜率，细胞直径对磁性迁移能力的效果是显而易见的。

对于相同放大值来说，较小细胞的直线的斜率要比那些具有较大曳力的大细胞的陡得多。

另外两个可能影响到细胞磁迁移能力的机制都与细胞表面积有关系。

如果一个细胞上的抗原表达水平是那个细胞的尺寸的函数，也就是说，相同的抗原密度，大细胞会显示出较大的抗体结合能力，那么，也就会显示出较大的磁迁移能力。

另外，大细胞会显示出较大的抗体结合能力，那么，也就会显示出较大的磁迁移能力。

另外，大细胞有着更多的表面积可用于磁性粒子结合，这样增加了能够结合在细胞上的磁性粒子的最大值（见图4），同样也增加了磁迁移能力的最大值（见图5）。

结论：

影响一个免疫磁性标记的细胞的磁迁移能力最大的参数是：

抗原表达水平（与ABC抗体结合能力有关）；用于进行细胞免疫磁性标记的抗体模型，即第一抗体（与ABC有关）和第二抗体（与ψ值有关），用于进行抗体结合的磁性粒子的种类ΔxVm,；细胞直径Dc。

对这些参数的全面理解可使用磁性细胞分离的人，可通过控制免疫细胞标记程序达到优化他们的分离效果的目的。

尽管对于一个特定细胞簇来说，抗体结合能力ABC和直径Dc是内在的本征生物学参数，但它们的值是可测的。

一个细胞的ABC值可通过使用为定量流式细胞仪设计的校准微珠来测定。

其他参数ψ和ΔxVm,，可以被用来调节以优化磁性细胞分离。

例如，如果想提高细胞标本的磁迁移能力，你可以通过以下两种方案达到你的目的：

要么使用间接抗体标记方案，这样每个第一抗体上结合的磁性粒子数目就大大增加了；要么，你可以使用较大的磁性粒子达到目的。

间接抗体标记方案增加的磁迁移能力最高可到4-5倍（从图5中可以看出），选用较大的磁珠则可能将磁迁移能力提高几个数量级（从图6可以看出）。

通过显著增加磁迁移能力，与免疫荧光标记能力相比较而言磁性免疫标记能力理论上可用来对具有较低抗原表达水平的细胞进行验证和分选。

除了要了解每一个参数的信息以外，更重要的是，也要知道在其他参数范围固定后，某一个参数固定的范围限制。

比如，从图4我们可以看出结合在一个15μm的细胞上的磁珠可以比一个7μm的细胞的磁珠数目要多上10倍，然而由于作用在细胞上的曳力的影响，对这个15μm的细胞来说，它的磁迁移能力只能比后者大2倍。

我们也可以看出，尽管较大的磁性粒子具有的磁性更强，由于空间位阻问题，这些大磁性粒子很少能够结合在细胞的表面。

磁性细胞分离为从非均相细胞混合物中分离得到想要的细胞簇提供了一种非常特异的，简单快速的技术。

然而，对于单个细胞簇来说要想优化其免疫磁性标记方案，必须有一个对免疫磁性标记的基本了解。

本论文中所展示的数据对磁迁移能力与细胞性质和各种免疫磁性标记参数之间的依赖关系进行了总结。

这些信息为磁性分离使用者提供了通过调节这些变量提高（或降低）免疫迁移能力的方法，从而达到优化他们的分离效率的目的。

术语表

ABC---抗体结合能力；Dc---细胞或微珠直径（m）

B-----磁通量密度（T）；Fb---作用在顺磁性纳米颗粒的磁场力（N）

Fbou---浮力（N）；Fd---曳力（N）

f------摩擦系数（Kg/s）；m----磁迁移能力（mm3/T•A•S）

nns----每个细胞上的非特异性结合位点数

ns-----每个细胞上的特异性抗原分子结合位点数

n1-----每个细胞上的抗原结合位点数

n2-----每个第一抗体上能够被第二抗体识别的结合位点数

n3-----结合在抗体上的磁性粒子数目

Sm-----磁性迁移驱动力（TA/mm2）=▽B2/2μ0

Vm-----每个顺磁性纳米颗粒的顺磁性材料体积（m3）

Vc-----运动细胞或微珠的速率（m/s）

Xb-----磁性材料的磁感应特性（SI单位系统）

Xf-----流体的磁感应特性（SI单位系统）

Δx----xb与xf的差值（SI单位系统）

η-----悬浮介质的黏度（Kg/m•s）

λ1------第一抗体的结合价态

λ2------第二抗体的结合价态

θ1------被第一抗体结合的磁性粒子表面的抗原位点的百分率

θ2-------被第二抗体结合的第一抗体表面位点的百分率

μ0-------自由空间的磁介导特性（T•m/A）

ψ----由于第二抗体在第一抗体表面进行多位点结合造成的二抗结合放大系数