国家自然科学基金成功标书申请书.docx
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国家自然科学基金成功标书申请书
项目类别
申报学科代码1
科学部编号
A
C010904
国家自然科学基金
申请书
项目名称：
申请者：
所在单位：
邮政编码：
通讯地址：
电话：
传真：
申请日期：
国家自然科学基金委员会
一九九七年制
一、简表
研究项目
名称
中文
刺
梨
白
粉
病
抗
性
候
选
基
因
的
克
隆
英文
CloningofPowderyMildewResistanceGeneCandidatesofCili（Rosaroxburghii）
类别
A.自由申请B.高技术探索C.青年D.地区
高技术探索
项目主题号
E.重大F.重点H.专项
D
申报学科
名称1
名称2
A.基础研究
B.应用基础
代码1
代码2
A
申请金额
起止年月
2003年1月至2005年12月
所用实验室
A.国家重点B.部门开放
实验室编号
13269202
A
申请者
姓名
中文
性别
A.男
出生年月
民族
民族
名称
汉
拼音
B.女
A
身份证号
代号
01
专业技术职务
名称
副教授
学位
A.博士
B.硕士
C.学士
博士学位
授予国别
或地区
国（地区）
中国
A.院士
B.博士生导师
C.博士后
代码
B
代码
156
所在单位
名称
系（所）
单位代码
性质
A.高等院校
B.科研机构
C.其它
邮政编码
隶属关系
名称
A
申请者电话
代码
所在地
项
目
组
总人数
高级
中级
初级
博士后
博士生
硕士生
参加单位数
主要成员（不含申请者）
姓名
身份证号
专业技术职务
所在单位名称及代码
项目中
的分工
签字
研究内容和意义
摘要
多
数
植
物
抗
病
基
因
编
码的
的
蛋
白
质
具
有
NBS-LRR
保
守
结
构
域
。
本
项
目
拟
以
我
国
特
有
果
树
——
刺
梨
为
试
材
，
基
于
NBS-LRR
结
构
域
设
计
简
并
引
物
，
扩
增
对
白
粉
病
抗
、
感
类
型
基
因
组
DNA
，
然
后
回
收
、
克
隆
后
选
基
因
片
段
；
应
用
双
假
测
交
原
理
，
采
用
BSA
法
，
确
定
克
隆
的
片
段
和
抗
病
性
的
关
系
；
通
过
构
建
BAC
文
库
，
以
获
得
后
选
抗
病
基
因
的
全
长
序
列
。
主题词
1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）。
中文
刺
梨
抗
病
后
选
基
因
克
隆
英文
Rosaroxburghii/Resistancegenecandidate/Cloning
简表填写要求
一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。
简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。
高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。
二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。
三、部分栏目填写要求：
项目名称──应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。
基础研究──指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。
应用基础研究──指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。
申报学科──申请项目所属的最基础学科。
如涉及多学科可填写两个，先填写主学科。
申请金额──以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。
起止年月──起始时间从申请的次年1月算起。
终止时间为完成年度的12月。
所用实验室──系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的
开放实验室。
所在单位名称及代码──按单位公章填写全称。
例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填
“中科院西安光机所”或“西安光机所”。
全称中的数字，一律写中文，例如：
中国航天工业总公司第七○一所。
首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编
入单位代码，其代码暂不填写。
参加单位数──指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位），以
阿拉伯数字表示。
项目组主要成员──指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作
用的人员，本人应在申请书上亲自签名。
本栏双线右侧内容不输入计算机。
研究内容和意义──摘要与主题词均录入软盘。
二、立论依据
（包括项目的和研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）
对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义;
对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。
刺梨（Rosaroxburghii,Tratt）属蔷薇科蔷薇属植物，集中分布于西南地区，在桂西北、湘西、鄂西及陕南等地也有分布。
其果实肉脆、甜酸、具浓郁的特殊香味，Vc含量高达2054~3541mg/100g，被誉为水果中的“Vc之王”（朱维藩等，1984）。
除鲜食外，更是加工高级饮品的优质原料，尤其是刺梨的防癌、抑癌作用和抗衰老、降血脂、增强免疫力、解铅中毒等保健作用已引起国内外的广泛关注（樊卫国等，1997；Maetal,1997），与猕猴桃、山楂并誉为我国三大新兴水果（史继孔等，1991）。
近年来，贵州省政府将其列为今后培育的八大产业经济之一，在西部开发的大潮中，亦将其作为特色产业来开发。
自上世纪80年代以来，经几代果树科研人员的辛勤耕耘,贵州选育出一些优良株系（朱维藩等，1984；向显衡等，1987），有的已直接用于大面积生产，产生了较大的经济效益。
先后有20多个省市从贵州引种，在部分地区建立了生产基地。
1815年，刺梨由传教士Roxburgh经印度引入欧洲，因其果实表面有刺，形同板栗的总苞而被称为栗玫瑰（Chestnutrose），在欧洲及美国等地将其作为观赏植物来培植（Fangan,1988）。
近年来的研究表明，刺梨对玫瑰的黑斑病（Blackspot）具有免疫能力，在玫瑰抗病育种中倍受青睐（Wiggersetal,1997）。
但是在刺梨的人工栽培中，白粉病（Sphaerotheca）为害严重，主要表现为4~6月为害刺梨的嫩叶和花果，造成叶片和花果脱落（庞纯翠等，1986）。
经过20多年的选育工作，获得了一个对白粉病高抗的株系（待发表），这一珍贵的种质资源为培育刺梨的白粉病抗性品种及直接分离抗性基因提供了物质基础。
不幸的是，迄今为止对刺梨的遗传基础研究极为薄弱。
过去人们对植物抗病基因的结构和功能缺乏认识，只能依赖图位克隆（Map-basedcloning/Positionalcloning）或转座子标签技术（Transposontagging）对植物抗病基因进行克隆，并在一些一年生植物上得到成功应用（董继新等，2001）。
但多拷贝基因的存在以及插入位点的随机性极大地限制了转座子标签法的应用范围（Dixonetal,1996），同时木本植物很难获得转座子突变体。
图位克隆法是近些年来发展起来的另一种有效方法，但高密度的分子标记遗传图谱是该方法不可逾越的一道鸿沟，目前的应用仅限于基因组较小的一些模式植物。
近年来，随着分子生物学和基因克隆技术的发展，对一些抗性基因的分子特性有了新的认识（Bakeretal,1997;Hammond-Kosacketal,1997;董继新等，2001），从而在一定程度上促进了基因的分离和克隆研究。
利用同源序列克隆技术（Homology-basedcloning）已成功地分离出小麦叶锈病抗性基因Lr10（Fenillet，1997）及拟南芥白粉病的广谱抗性基因RPW8（Xiaoetal,2001）。
剖析已克隆的20余例植物抗病基因，发现大多数抗病基因编码的蛋白质都含有核苷酸结合位点（Nucleotidebindignsite,NBS）和亮氨酸富集重复序列（Leucine-richrepeat，LRR）结构域（董继新等，2001；郑先武等，2001；Dengetal,2000），如拟南芥Rps2、Rpm1、Rpp5基因，番茄Prf和I2基因，亚麻的L6和M6基因，烟草的N基因等（Mindrinosetal,1994;Whithametal,1994;Hammond-Kosacketal,1997）。
诸多研究显示，以这些保守氨基酸序列设计简并引物对进行PCR扩增，获得的部分抗病候选基因（Resistancegenecandidate，RGC）或抗病基因类似物（Resistancegeneanalog，RGA）和已知的病毒、细菌、真菌或线虫抗性基因位点紧密连锁，有的甚至就来自于抗性基因（郑先武等，2001；Kanazinetal,1996;Shenetal,1998;Speulmanetal,1998;Dengetal,2000）。
这不仅预示了植物抗病基因抗病的可能机理，也为抗病基因的克隆提供了新途径（Hammond-Kosacketal,1997），特别是对于生命周期长，遗传上高度杂合，遗传背景知之甚少的果树，基于这些保守结构域的同源序列克隆法已引起学术界的极大兴趣（Dengetal,2000）。
采用同源序列法克隆抗病候选基因，有很多成功的报道。
Leister等（1996）根据拟南芥的抗病基因RPS2和烟草的抗病基因N的高度保守的LRR序列设计引物，对马铃薯基因组DNA进行PCR扩增，获得了与已知抗病基因同源、与抗线虫病基因Grol和抗晚疫病基因R7完全连锁的DNA片段。
Yu等（1996）根据烟草N和拟南芥RPS2基因编码蛋白质的NBS同源序列设计简并引物，从大豆中克隆出11类含NBS序列的片段，其中5个定位于已知的抗病基因附近；贺英超等（2001）以抗花叶病毒的大豆品种为试材，基于大多数抗病基因的NBS-LRR保守区域的特点，设计特异简并引物对，克隆出与大豆抗花叶病毒基因Rsa位于同一连锁群的KNSB2序列，经Northern检测，KNSB2在大豆的根、茎和叶中为低丰度的组成型表达。
同样，以NBS-LRR结构设计的简并引物对，从水稻中克隆出了大小约520bp的片段，通过序列比较分析发现，其编码产物属于抗病基因同源序列，并发现其中一个来自抗白叶枯病基因家族（郑先武等，2001）。
在水稻及禾本科的其他作物上，也开展了卓有成效的工作（薛永彪等，1998；Spielmeyeretal,1998）。
迄今为止，基于抗病基因的NBS-LRR结构域而采用同源序列法克隆RGC的一年生作物还有大麦（Seahetal,1998）、小麦（薛永彪等，1998；Seahetal,1998）、菜豆（Creusotetal,1999）、莴苣（Shenetal,1998）和番茄（Ohmorietal,1998）等。
但是应该看到，该方法在多年生作物上报道很少，仅在柑桔上，Deng等人（2000）取得了较大进展，克隆出39个RGC，部分RGC和抗柑桔速衰病（Ctv）及柑桔线虫抗性基因（Tyr1）紧密连锁，为发展柑桔抗病基因分子标记和全基因的克隆奠定了坚实基础。
因此，基于NBS-LRR的同源序列法获得的RGC，不但可发展为植物抗病基因的更精确定位的分子标记，而且有可能广泛应用于包括多年生果树在内的其他作物抗病基因的克隆策略中（（薛永彪等，1998；Hammond-Kosacketal,1997;Speulmanetal，1998；Dengetal,2000）。
抗病性状分子标记的遗传分析，通常采用近等位基因系（Near-isogeniclines,NILs）为试材，但对包括木本植物在内的绝大多数植物，要获得近等位基因系非常困难。
为此，Michelmore等（1991）开发了集团分离体分析法（Bulkedsegregantanalysis,BSA），其作法为以F2代群体为材料，按目标性状的表现（如抗病性强弱），挑选出两个极端类型组成两个基因池（BulksorPools），每个池内的目标性状一致而不管其它性状的表现，这样两个基因池分子标记的多态性既与用于构建基因池的目标性状连锁。
该方法也可应用于数量性状研究（Lingetal,2000）。
但是，对生长周期长、树体高大、很多种类自交不育的果树来说，要构建F2代群体绝非易事，目前仅在桃上有采用F2代进行BSA的报道（Chaparroetal,1994）。
实际上，绝大多数果树栽培品种为杂合体，许多基因位点都会在自交或杂交中分离，采用双亲都为高度杂合的品种或株系杂交，其杂交一代性状分离复杂，产生双假测交（Doublepseudotestcross）现象，利用其F1代群体，应用BSA法可以直接进行果树的基因定位（卢江，1995）。
该方法已在苹果、柑桔等遗传背景复杂的多年生果树上得到成功应用（Dengetal,2000）。
在植物白粉病抗性基因的克隆上，前人取得了很大进展。
Buschges等（1997）采用图位克隆法分离出大麦白粉病抗性基因Mlo；Xiao等（2001）采用同源序列法分离出拟南芥白粉病广谱抗性基因RPW8；而通过NBS设计简并引物的策略，在大豆上克隆出与大豆白粉病抗性连锁的2类共7个候选基因，为基因的全序列克隆奠定了基础（Yuetal,1996）。
这表明，基于NBS-LRR的同源序列法有可能分离出植物的白粉病RGC。
本研究拟以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用大多数植物抗病基因所具有的NBS-LRR结构特征，设计特异简并引物对进行PCR，分离和克隆候选基因。
同源序列克隆与BSA结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传、物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。
通过刺梨的白粉病高抗和极感株系的杂交后代，采用BSA法，由此确定克隆出的RGC与刺梨白粉病抗性的遗传关系。
并以与刺梨白粉病抗病紧密连锁或共分离的RGC转化为探针，筛选文库，以期获得完整的基因。
课题的实施，对刺梨白粉病抗性候选基因的获得，分子标记辅助选择抗病类型具有重大意义，并为最终获得完整的抗病基因及进一步开展重要性状的遗传定位奠定坚实的物质和技术基础。
主要参考文献
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