志贺氏菌检测.docx
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志贺氏菌检测
志贺氏菌检测
志贺氏菌检测
1设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1恒温培养箱：
36℃±1℃；
1.2冰箱：
2℃～5℃；
1.3膜过滤系统；
1.4厌氧培养装置：
41.5℃±1℃；
1.5电子天平：
感量0.1g；
1.6显微镜：
10×～100×；
1.7均质器；
1.8振荡器；
1.9无菌吸管：
1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头；
1.10无菌均质杯或无菌均质袋：
容量500ml；
1.11无菌培养皿：
直径90mm；
1.12pH计或pH比色管或精密pH试纸；
1.13全自动微生物生化鉴定系统。
2培养基和试剂
3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：
见附录中1。
3.2麦康凯（MAC）琼脂：
见附录中2。
3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：
见附录中3。
3.4三糖铁（TSI）琼脂：
见附录中4。
3.5营养琼脂斜面：
见附录中5。
3.6半固体琼脂：
见附录中6。
3.7葡萄糖铵培养基：
见附录中7。
3.8尿素琼脂：
见附录中8。
3.9β-半乳糖苷酶培养基：
见附录中9。
3.10氨基酸脱羧酶试验培养基：
见附录中10。
3.11糖发酵管：
见附录中11。
3.12西蒙氏柠檬酸盐培养基：
见附录中12。
3.13粘液酸盐培养基：
见附录中13。
3.14蛋白胨水、靛基质试剂：
见附录中14。
3.15志贺氏菌属诊断血清。
3.16生化鉴定试剂盒。
4操作步骤
4.1增菌
以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。
于41.5℃±１℃，厌氧培养16h～20h。
4.2分离
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。
宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。
若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。
志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。
表1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
志贺氏菌的菌落特征
MAC琼脂
无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐
XLD琼脂
粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐
4.3初步生化试验
4.3.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。
4.3.2凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。
4.4生化试验及附加生化试验
4.4.1生化试验
用4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。
除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性；宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型，鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。
另外由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。
生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。
志贺氏菌属生化特性见表2。
表2志贺氏菌属四个群的生化特征
生化反应
A群：
痢疾志贺氏菌
B群：
福氏志贺氏菌
C群：
鲍氏志贺氏菌
D群：
宋内氏志贺氏菌
β-半乳糖苷酶
－a
－
－a
+
尿素
－
－
－
－
赖氨酸脱羧酶
－
－
－
－
鸟氨酸脱羧酶
－
－
－b
+
葡萄糖胺
－
－
－
－
+
+
西蒙氏柠檬酸盐
－
－
－
－
d
d
粘液酸盐
－
－
－
d
+
d
注1：
+表示阳性；－表示阴性；d表示有不同生化型。
注2：
在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性。
4.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据4.3.2的初步判断结果，用4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
4.5血清学鉴定
4.5.1抗原的准备
志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。
志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。
菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。
一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
注1：
一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水做成浓菌液，100℃煮沸15min～60min去除K抗原后再检查。
注2：
D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。
与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。
宋内氏志贺氏菌没有K抗原。
4.5.2凝集反应
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。
再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。
将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。
如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝。
这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。
如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按4.5.1注1进行试验。
附录培养基和试剂
1志贺氏菌增菌汤-新生霉素（Shigellabroth）
1.1志贺氏菌增菌肉汤
1.1.1成分
胰蛋白胨20.0g
葡萄糖1.0g
磷酸氢二钾2.0g
磷酸二氢钾2.0g
氯化钠5.0g
吐温801.5ml
蒸馏水1000ml
pH7.0±0.2
1.1.2制法
将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右校正pH，分装适当的容器，121℃灭菌15min，取出后冷却至50℃～55℃，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5μg/ml），分装225ml备用。
注：
如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。
1.2新生霉素溶液
1.2.1成分
新生霉素25.0mg
蒸馏水1000ml
1.2.2制法
将新生霉素溶解于蒸馏水中，用0.22μm过滤膜除菌，如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。
1.3临用时每225ml志贺氏菌增菌肉汤（1.1）加入5ml新生霉素溶液（1.2），混匀。
2麦康凯（MAC）琼脂
2.1成分
蛋白胨20.0g
乳糖10.0g
3号胆盐1.5g
氯化钠5.0g
中性红0.03g
结晶紫0.001g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.2±0.2
2.2制法
将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右校正pH，分装，121℃高压灭菌15min。
冷却至45℃～50℃，倾注平板。
注：
如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存二周。
3木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
3.1成分
酵母膏3.0g
L-赖氨酸5.0g
木糖3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
脱氧胆酸钠1.0g
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠6.8g
柠檬酸铁铵0.8g
酚红0.08g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
3.2制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，校正pH。
另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平皿。
注：
本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。
本培养基宜于当天制备，第二天使用。
使用前必须去除平板表面上的水珠，在37℃～55℃温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干。
另外如配置好的培养基不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存二周。
4三塘铁（TSI）琼脂
4.1成分
蛋白胨20.0g
牛肉浸膏5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
硫酸亚铁铵（NH4）2Fe（SO4）·6H2O0.2g
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠0.2g
酚红0.025g
琼脂12.0g
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
4.2制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加于400ml蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热使完全溶化，冷却至25℃左右校正pH至7.4±0.2。
另将琼脂加于600ml蒸馏水中，静置约10min，加热使完全溶化。
将两溶液混合均匀，加入5%酚红水溶液5ml，混匀，分装小号试管，每管约3ml。
于121℃灭菌15min，制成高层斜面。
冷却后呈桔红色。
如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。
5营养琼脂斜面
5.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉膏3.0g
氯化钠5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.0±0.2
5.2制法
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ml，冷却至25℃左右校正pH至7.0±0.2。
加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。
分装小号试管，每管约3ml。
于121℃灭菌15min，制成斜面。
注：
如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存二周。
6半固体琼脂
6.1成分
蛋白胨1.0g
牛肉膏0.3g
氯化钠0.5g
琼脂0.3g～0.7g
蒸馏水100ml
pH7.4±0.2
6.2制法
按以上成分配好，加热溶解，校正pH，分装小试管，121℃灭菌15min，直立凝固备用。
7葡萄糖胺培养基
7.1成分
氯化钠5.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g
磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g
葡萄弹2.0g
琼脂20.0g
0.2%溴麝香草酚蓝水溶液40.0ml
蒸馏水1000ml
pH6.8±0.2
7.2制法
先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加入琼脂加热溶解，然后加入指示剂。
混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min。
制成斜面备用。
8尿素琼脂
8.1成分
蛋白胨1.0g
氯化钠5.0g
葡萄糖1.0g
磷酸二氢钾2.0g
0.4%酚红溶液3.0ml
琼脂20.0g
20%尿素溶液100.0ml
蒸馏水1000ml
pH7.2±0.2
将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121℃高压灭菌15min。
8.2制法
除酚红和尿素外的其他成分加热溶解，冷却至25℃左右校正pH，加入酚红指示剂，混匀，于121℃灭菌15min。
冷至约55℃，加入用0.22μm过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100ml，混匀，以无菌操作分装灭菌试管，每管约3ml～4ml，制成斜面后放冰箱备用。
8.3试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h，观察结果。
尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
9β-半乳糖苷酶培养基
9.1液体法（ONPG法）
9.1.1成分
邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5±0.2）10.0ml
1%蛋白胨水（pH7.5±0.2）30.0ml
9.1.2制法
将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管内，每管0.5ml，用橡皮塞塞紧。
9.1.3试验方法
自琼脂斜面挑取培养物一满环接种，于36℃±1℃培养1h～3h和24h观察结果。
如β-D-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。
9.2平板法（X-Gal法）
9.2.1成分
蛋白胨20.0g
氯化钠3.0g
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）200.0mg
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml
pH7.2±0.2
9.2.2制法
将各成分加热煮沸于1L水中，冷却至25℃左右校正pH，115℃高压灭菌10min。
倾注平板避光冷藏备用。
9.2.3试验方法
挑取琼脂斜面培养物接种于平板，划线和点种均可，于36℃±1℃培养18h～24h观察结果。
如果β-D-半乳糖苷酶产生，则平板上培养物颜色变蓝色，如无此酶则培养物为无色或不透明色，培养48h～72h后有部分转为淡粉红色。
10氨基酸脱羧酶试验培养基
10.1成分
蛋白胨5.0g
酵母浸膏3.0g
葡萄糖1.0g
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0ml
L型或DL型赖氨酸和鸟氨酸0.5g/100ml或1.0g/100ml
蒸馏水1000ml
pH6.8±0.2
10.2制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸和鸟氨酸。
L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入，再校正pH至6.8±0.2。
对照培养基不加氨基酸。
分装于灭菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层石蜡油，115℃高压灭菌10min。
10.3试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养18h～24h，观察结果。
氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。
阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。
阴性对照管应为黄色，空白对照管为紫色。
11糖发酵管
11.1成分
牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠3.0g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0ml
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
11.2制法
11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5％加入葡萄糖，25℃左右校正pH，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。
11.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100ml，121℃高压灭菌15min。
另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。
将5ml糖溶液加入于100ml培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：
蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
11.3试验方法
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养,一般2d～3d。
迟缓反应需观察14d～30d。
12西蒙氏柠檬酸盐培养基
12.1成分
氯化钠5.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g
磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g
柠檬酸钠5.0g
琼脂20g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液40.0ml
蒸馏水1000ml
pH6.8±0.2
12.2制法
先将盐类溶解于水内，调至pH，加入琼脂，加热溶化。
然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃灭菌15min。
制成斜面备用。
12.3试验方法
挑取少量琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养4d，每天观察结果。
阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。
13粘液酸盐培养基
13.1测试肉汤
13.1.1成分
酪蛋白胨10.0g
溴麝香草酚蓝溶液0.024g
蒸馏水1000ml
粘液酸10.0g
pH7.4±0.2
13.1.2制法
慢慢加入5N氢氧化钠以溶解粘液酸，混匀。
其余成分加热溶解，加入上述粘液酸，冷却至25℃左右校正pH至，分装试管，每管约5ml，于121℃高压灭菌10min。
13.2质控肉汤
13.2.1成分
酪蛋白胨10.0g
溴麝香草酚蓝溶液0.024g
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
13.2.2制法
所有成分加热溶解，冷却至25℃左右校正pH，分装试管，每管约5ml，于121℃高压灭菌10min。
13.3试验方法
将待测新鲜培养物接种测试肉汤和质控肉汤，于36℃±1℃培养48h观察结果，肉汤颜色蓝色不变则为阴性结果，黄色或稻草黄色为阳性结果。
14蛋白胨水、靛基质试剂
14.1成分
蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g
氯化钠5.0g
蒸馏水1000mL
pH7.4
14.2制法
按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。
注：
此试剂在2℃～8℃条件下可储存一个月。
14.3靛基质试剂
14.3.1柯凡克试剂：
将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中。
然后缓慢加入浓盐酸25ml。
14.3.2欧－波试剂：
将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95%乙醇内。
然后缓慢加入浓盐酸20ml。
14.4试验方法
挑取少量培养物接种，在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。
加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注：
蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。
每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用，此试剂在2℃～8℃条件下可储存一个月。
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