生物科技行业分子生物学检验技术实验指导.docx
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生物科技行业分子生物学检验技术实验指导
(生物科技行业)分子生物学检验技术实验指导
实验壹小鼠肝组织DNA的提取及鉴定
【实验目的】
1、掌握动物组织DNA提取的方法;
2、掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】
获得相当纯度和完整性的基因组DNA,可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。
因此,DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。
较理想的DNA样品应达到以下三点要求:
①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染;③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中,提取DNA的原则是即要将DNA和蛋白质、脂类和糖类等成分分离,又要保持DNA分子的完整。
本实验中,用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS)消化破裂细胞膜、核膜,且使组织蛋白变性沉淀,DNA从核蛋白中游离分开;为控制组织中脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA的降解,加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)以除去激动该酶的金属离子,SDS也能使DNase变性失活;蛋白酶K可水解蛋白质,消化DNA酶;分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质,接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染;最后用无水乙醇沉淀DNA,得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸收峰,测DNA的A260,可计算其浓度。
而蛋白质在280nm处有最大吸收峰,可测定A260nm/A280nm比值,检测DNA的纯度,该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】
1、动物
小白鼠
2、设备
移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等;751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂
(1)基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技X公司):
包括BufferCL、BufferPP、BufferGE、RNaseA、ProteinaseK
(7)生理盐水,4℃贮存
(8)无水乙醇、70%乙醇
【操作步骤】
1、制备肝匀浆
迅速处死小白鼠,称取新鲜肝脏组织50mg,用预冷生理盐水洗去血液,滤纸吸干后剪碎组织,将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨,同时加入300μlBufferCL。
将肝匀浆液放入EP管,加入1.5μl蛋白酶K,漩涡震荡10s,55℃孵育直到组织溶解(约1小时)。
2、提取DNA
(1)加入1.5μlRNaseA,颠倒混匀,37℃孵育15-60min。
(2)冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。
(3)加入1/3体积的BufferPP,涡旋震荡20s,12000rpm离心3min。
(4)将上清转移到—个新的离心管中,加入等体积异丙醇,轻轻颠倒混匀,可见絮状沉淀(纤维状DNA)从溶液中析出。
12000rpm离心1min,弃上清。
(5)加入300μl70%乙醇,颠倒数次以洗涤DNA沉淀。
12000rpm离心1min,弃上清,室温干燥15min。
(6)加入50μlBufferGE溶解DNA(如果DNA的量比较大,能够65℃孵育以促进DNA的溶解),室温保存待测。
3、DNA浓度和纯度的测定
取0.1mlDNA样品,加蒸馏水至1ml,在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。
计算:
DNA浓度(μg/ml)=A260×50×10(请问系数50、10是如何得来的?
)
DNA纯度=A260nm/A280nm
【注意事项】
(1)由于DNA主要存在于细胞核内,为便于提取DNA,肝脏的破碎要严格控制好。
即要尽可能的将细胞膜破碎,又要尽可能多保留完整的细胞核,以保留60~70%的完整细胞核为宜。
为避免DNA过度断裂,不宜用电动研磨器制备匀浆。
在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提,混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。
(2)用氯仿除去组织蛋白,要不断振荡使蛋白质变性。
如要得到高纯度DNA,可加入蛋白酶K降解蛋白质。
(3)酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应避免接触皮肤。
(4)室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉(DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉),但不要让DNA完全干燥,否则极难溶解,DNA溶解过程通常需要12-24hr。
(5)提取过程应尽量保持低温。
(6)在波长260nm紫外线下,1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡核苷酸为20μg/ml。
据此来计算核酸样品的浓度。
紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。
(7)A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间,若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA,如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。
应根据后续实验要求,采取不同的方法纯化。
当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA,其比值介于1.8~2.0的情况,所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA,或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。
【结果】
1、A260=,A280=。
2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。
3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。
【思考题】
1、提取和纯化的真核组织DNA有何用途?
2、你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间?
有何意义?
3、请结合你的实验结果和操作步骤,分析如何检测和保证DNA的质量?
实验二聚合酶链反应
【实验目的】
采用聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白(SM22α)基因
【实验原理】
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)用于体外扩增位于俩段已知序列之间的DNA区段(靶序列)。
其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。
反应中使用俩条化学合成的寡核苷酸作为引物,分别和模板DNA俩条单链互补,待扩增序列片段位于俩条引物之问。
PCR扩增包括3个步骤,即变性、退火和延伸。
反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参和。
反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链,随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下,使引物能和靶序列形成杂交双链(退火)。
当温度升至72℃左右时,反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端,使互补链从5‘向3’方向不断延伸,直至形成新的DNA双链。
通过变性、退火和延伸的壹个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加壹倍。
由于每次扩增的产物又作为下壹次扩增的模板,因此反应产物的量以指数形式增长,壹个分子的模板经过n个循环可得2n个分子拷贝产物。
本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白(SM22α)基因,扩增产物片段大小为541bp。
扩增所用的上游引物序列为:
5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’,下游引物序列为:
5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。
【实验器材和试剂】
1、设备
PCR仪、0.2mlPCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。
2、试剂(20μl体系)
PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技X公司)
【操作步骤】
1、分别在PCR反应管中加入2×PCRmix10μl、上游和下游引物各2μl、DNA2μl和H2O4μl。
2、把PCR反应管放人PCR仪,按仪器操作要求启动扩增程序。
本实验的扩增程序为:
94℃预变性5分钟后进入循环扩增,即94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min。
重复35个循环后,于72℃再延伸10min,最后4℃保温。
3、反应结束后,将PCR反应管于12000rpm离心15s,取扩增产物进行电泳分析。
【注意事项】
1、由于PCR技术的灵敏度高,极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。
因此,必须采取相应措施避免发生污染。
2、PCR实验应设立阴性对照反应,即在反应体系中不加模板DNA。
3、多份样品同时扩增时,可配制总的反应混合液,且分装于PCR管中,然后再在各管中分别加入模板。
4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行,实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。
PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。
5、PCR试剂和模板DNA及样品应分别保存于不同功能区的冰箱中。
6、操作时应戴手套,配制反应体系和加模板时应分别使用专用的移液器,所有耗材使用前必须经高压灭菌,用后按规定处理且丢弃在指定容器中。
【结果】
【思考题】
1、PCR各组分在反应中的作用是什么?
2、降低退火温度、延长变性时间会对反应有何影响?
实验三琼脂糖凝胶电泳
【实验目的】
掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。
【实验原理】
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用技术。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不壹样,可进行分离。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也能够分离相对分子质量相同,及构型不同的DNA分子。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广。
荧光染料溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中形成复合物,紫外光照射下EB能发射荧光,而且荧光的强度正比于核酸的含量。
由于EB是致癌剂,当下开发出了安全的染料,如SyberGreen、GelRed、GoldView等。
【仪器和试剂】
1.仪器
天平、锥形瓶、微波炉(或电炉)、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪(或紫外线透射仪)、微量可调移液器、移液管、量筒、壹次性塑料手套。
2.试剂
(1)50×TAE电泳缓冲液:
Tris碱242.0g、冰乙酸57.1ml、EDTA63.5g、NaOH10.0g,加蒸馏水至1000ml,使用前用蒸馏水稀释至1×TAE电泳缓冲液。
(2)6×loadingbuffer:
(0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯氰FF,30%甘油水溶液)或(0.25%溴酚蓝,40%(w/v)蔗糖水溶液),贮存于4℃。
(3)电泳级琼脂糖(Agarose)、溴化乙锭(母液:
将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可)、DNAMarker、DNA、蒸馏水。
【实验步骤】
1.配制1.5%的琼脂糖凝胶:
精确称取1.5g电泳级琼脂糖,加入100ml1×TAE电泳缓冲液,在微波炉里(或电炉)加热使琼脂糖颗粒完全溶解(加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发),待胶冷却至55ºC左右时,加入20µl溴化乙锭(也可先不加EB,而是电泳后再用0.5µg/ml的EB溶液浸泡染色),轻轻旋转混匀。
插入合适的梳子,将溶液倒入制胶板中,待凝结后拔去梳子待用。
2.加样:
将凝胶置于电泳槽,加入1×TAE电泳缓冲液覆盖胶面即可。
各取PCR产物和DNA分子量参照物10µlDNA加入1µl6×loadingbuffer,混合后上样,分别加入琼脂糖凝胶孔内。
加样时切勿破坏点样孔周围的凝胶。
3.电泳:
合上电泳槽盖,打开电泳仪,控制电压保持在60-80V,电流在40mA之上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
4.染色:
未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
5.观察和拍照:
电泳完成后切断电源,取出凝胶,置于凝胶成像分析仪上观察电泳结果,且照相记录。
或在波长为254nm的紫外灯下观察DNA的荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
【注意事项】
1.影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素:
(1)DNA大小:
迁移速率和logN成反比(N为碱基对数目)。
分子越大,迁移越慢。
分子量相同的空间结构越紧密的电泳越快,如超螺旋>线性DNA。
(2)琼脂糖凝胶浓度:
不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNA:
琼脂糖凝胶浓度
可分辨的线性DNA片段大小(kb)
0.5%
5-60
0.7%
0.8-12
1.0%
0.4-6
1.5%
0.2-4
1.75%
0.2-3
2.0%
0.1-3
(3)DNA构象:
壹般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
当条件变化时,情况会相反,仍和琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
(4)所加电压:
低电压时,线状DNA片段的迁移速率和所加电压成正比。
使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过20V/cm,电泳温度应该低于30℃。
(5)嵌入染料的存在:
降低线性DNA迁移率(不提倡加在电泳液中)。
(6)电泳缓冲液(0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率。
无离子存在时,核酸基本不泳动;离子强度过大产热厉害,熔化凝胶且导致DNA变性。
壹般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTApH8.0)。
2.溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染,凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
3.电泳指示剂:
核酸电泳常用的指示剂有俩种,溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylenecyanol,Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
【实验结果和分析】
1.电泳过程中,你自己或本组所采用的电压为________伏特(v),电流为_______毫安(mA),通电时间为_______分钟。
2.在实验报告上描画自己或实验组的电泳图谱,标明阳极和阴极位置。
【思考题】
你的电泳结果如何?
成功或失败有哪些方面的原因?
进行琼脂糖凝胶电泳时应注意哪些问题?