工厂化育苗.docx

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工厂化育苗

工厂化育苗复习材料

提示：

本材料只包含65分的考试题目，其他的35分需要大家自己多看看书、笔记和ppt。

1、褐变：

指对于富含多酚化合物的植物，在接种时由于切割或剥离使组织收到伤害，该类物质会在多分氧化酶的作用下氧化褐变，是培养基变黑，并严重抑制外植体生长和分化，严重时导致培养物死亡。

2、玻璃化现象：

指组织培养中，呈现半透明状的畸形试管植物，这类植物被称为“玻璃化苗”。

在离体培养中，再生植株长成玻璃苗的现象，被称做玻璃化作用。

3、胚状体：

在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经了一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体

4、植物组织培养：

植物组织培养（planttissueculture）是指无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术与方法，通常又称为植物离体培养

5、植物细胞全能性：

每一个植物细胞带有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。

6、污染：

污染是指在组培过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生大量菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。

7、植物无糖组培快繁技术：

又称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输入CO2气体作为碳源，并控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术。

8、原球茎：

原球茎是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。

种子萌发初期不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂、肿胀的胚呈小圆锥状，称为原球茎

9、植物工厂：

是植物栽培的最高境界，是植物生长发育的最佳环境，它集成了全自动全智能的环境模拟技术为植物的生长与发育创造出最佳的人工环境，是完全可控可调的按照人的意志进行管理的栽培系统

10、愈伤组织：

是指在培养或自然条件下，植物细胞脱分化，不断增殖所产生的主要由薄壁细胞构成的不定形的组织。

11、组织培养实验室必要的设备：

1、基本设备：

电炉、冰箱、酸度计、天平、纯水器、搅拌器

2、灭菌设备：

蒸汽灭菌压力锅、过滤灭菌装置、紫外线灭菌灯

3、无菌操作设备：

超净工作台、无菌接种箱

4、培养设备：

恒温振荡培养箱、光照培养箱、摇床

5、细胞学鉴定设备：

光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜

12、外植体选择原则：

1、再生能力强；2、遗传稳定性好；3、外植体来源丰富；4、外植体灭菌容易

13、培养基成分：

①水分；②无机盐类；③有机营养成分；④植物生长调节物质；⑤天热物质； ⑥pH；⑦凝固剂等

14、温度是影响外植体生长和分化的重要条件，大多数情况下，由于一个培养室内培养着许多种植物，培养室内的温度一般被设定：

25℃±2℃

15、活性炭作用：

吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质

抑制外植体褐变

防止玻璃苗的产生

促进培养物生长和分化

促进生根

16、植物快繁技术过程中，根据器官形成方式的不同，植物器官的再生种类

根据器官形成方式的不同，将植物器官的再生分为五种类型，即短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型和原球茎发生型。

17、糖的作用

生命活动中必不可少的碳源和能源

调节培养基渗透压

18、在固体培养时使用最方便、最好的凝固剂：

琼脂

19、试管苗的年生长量（Y）决定因素：

Y=mXn

m-无菌母株苗数；X-每隔培养周期增殖的倍数；n-全年可增殖的周期数

20、培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径：

茎尖培养脱毒

21、生长素／细胞分裂素比值的高低决定着外植体的发育方向

比值低时促进根的生长，这时脱分化占主导地位；比值高促进芽的生长，这时分化占主导地位。

22、生物学脱毒生产无毒植株的方法

1.茎尖组织培养脱毒法

2.愈伤组织培养脱毒法

3.微体嫁接离体培养脱毒法

4.珠心组织培养脱毒法

23、培养基灭菌（p20）

1、高压蒸汽灭菌法

2、过滤除菌法

24、植物细胞全能性提出、发展与完善的

1902年，haberlandt提出了植物细胞的全能性，即植物的体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的能力。

20世纪70年代，细胞全能型的概念被解释为：

每一个细胞具有该植物的全部遗传信息，具有发育成完整植株的能力。

80年代，此概念又进一步被解释为：

每一个植物细胞带有该植物的全部遗传信息，在适当的条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。

25、常用的脱病毒植株检测方法和特点

（－）直接测定法

（二）指示植物法

（三）血清鉴定方法

（四）核酸分祈法

（五）电镜鉴定法

26、通过组织培养获得微型薯的技术关键步骤

27、使用高压灭菌锅时注意事项：

1、使用高压锅前应添加足够的水

2、锅内气压太高会引起部分有机物质的分解

3、灭菌后在气压表归零之前不要打开锅盖，以免发生危险和培养基外溅现象

4、橡胶等有机物品会因高温高压而变性；

5、高压灭菌锅内有一个自动排气的小孔，不要使其堵塞，否则会因气压升高而引起危险

28、在组培苗工厂化生产中，生产成本及降低商业化生产成本

生产成本：

①人工费用。

②生产物资费用。

③设备折旧费用。

④水电费用。

⑤其他费用。

降低措施：

针对试管苗生产所需的费用，应采取相应措施降低生产成本，增强产品竞争力，提高试管苗经济效益。

1.提高劳动生产率

2.减少设备投资，延长使用寿命

3.降低消耗

4.降低污染，提高繁殖率和成活率

5.简化培养基

29、植物快繁的程序

植物快繁的程序包括四个阶段：

1、无菌（或初代）培养的建立；2、繁殖体增殖；3、芽苗生根；4、小植株的移栽驯化

30、康乃馨试管苗开花条件

培养基：

1/2MS大量和微量元素十NAA0.2mg/L十活性炭0.5%＋蔗糖3%十琼脂0.7%

培养条件：

温度22~28℃、每天光照约10h、光照强度约1000lx的人工气候箱中培养。

2个月后可分化出相当数量的花芽，分化率约56%。

3~4个月后白色花开放。

31、组织培养用的培养基配制

1、培养基母液的配制

为了减少工作量，减小误差，最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液。

（1）配置原则：

相同类型的试剂混合；

易形成沉淀的药品分开；

母液浓度要适宜；

用量要认真计算和核对；

药品要准确称量

2.MS培养基母液的配制

MS培养基母液根据试剂特性通常配成五种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe盐（100倍）、Ca盐（50倍）、有机物（100倍）。

3.激素母液的配制

生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95％乙醇溶解；

细胞分裂素类用1NHCl或1NNaOH溶解。

常激素母液浓度生长素类为0.1~0.5mg/ml,细胞分裂素母液浓度为0.2~1.0mg/ml.

培养基的配制的具体步骤：

1、取出母液并按顺序放好。

将洁净的各种玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置；

2、取一只容量瓶，放入配制培养基总量的1/3左右纯水，将母液按顺序加入，不断搅拌；

3、加入植物生长调节剂后定容；

4、将定容的培养基倒入容器中，加入蔗糖和琼脂，并加热使其完全溶解；

5、调整pH；

6、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；

7、灭菌，用高压锅灭菌（121℃，15～20min）或过滤除菌；

8、灭菌后待高压锅温度下降到50℃以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。

32、试管苗的生态环境（要自己拓展）

高温且恒温

高湿

弱光

无菌

33、草莓组培脱毒的方法与病毒检测手段

脱毒的方法主要有：

1.茎尖培养法

剪取5cm左右的顶梢→剪去叶片→自来水冲洗→70％酒精浸3～5s→0.1％升汞消毒2～10min→无菌水冲洗3～5次→剥离茎尖外面的幼叶和鳞片→切取茎尖分生组织→接种于诱导培养基MS+BA0.5+GA30.1+IBA0.2→分化培养基MS+BA0.5～1.0→20d分化丛生芽→生根培养基1/2MS+IBA0.2～1.0→生根→炼苗→移栽

2.茎尖培养和热处理相结合

（1）40℃处理16h，35℃处理8h；时间4～5周

（2）38℃恒温，湿度60～70％，处理12～50d

（3）35℃7d，38℃，湿度40～68％，光照强度4000～5000Lx，35d

3.花药培养法。

取单核期的花蕾→低温（4～5℃）处理24h→70％酒精浸3～5s→0.1％升汞消毒10～15min→无菌水冲洗3～5次→剥离花冠，取下花药→接种→诱导愈伤组织培养基MS+BA1.0+NAA0.2+IBA0.2→20d愈伤组织→培养基MS+BA1.0+IBA0.05→50～60d植株

脱毒苗的检测

1.指示植物小叶嫁接鉴定法

2.电子显微镜鉴定法

34、培养基的基本类型及其特点：

培养基形态不同：

固体培养基、液体培养基

培养过程不同：

初代培养基、继代培养基

其作用不同：

诱导培养基、增殖培养基、生根培养基

营养水平不同：

基本培养基、完全培养基

成分和浓度不同：

含盐量较高的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含量的培养基

1、MS培养基：

无机盐浓度高；

高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；

含有一定数量的铵盐；

营养丰富；

不需要添加更多的有机附加物；

2、White培养基：

1943年由White为培养番茄根尖而设计；

1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素；

无机盐浓度较低；

使用广泛；

在生根培养、胚胎培养中有良好的效果；

3、B5培养基：

1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计；

含有较低的铵盐；

较高的硝酸盐和盐酸硫胺素；

4、N6培养基：

1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计；

KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼；

35、一般组织培养的操作程序

36、胡萝卜体胚发生体系的建立程序及影响体胚发生的影响因素。

（1）愈伤组织的诱导和保存

外植体：

无菌苗的下胚轴（长0.5cm）、消毒叶柄（长0.5~1.0cm）、贮藏根（横切面0.5cm2）。

诱导培养基：

MS＋2,4-D0.1~1.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L。

培养条件：

26℃、黑暗条件下培养4~8周，即可获得愈伤组织。

继代培养：

相同成分的悬浮培养基上或固体培养基上。

2）体细胞胚的诱导

继代4次以上的愈伤组织，用不锈钢的32μm、63μm和125μm的过滤筛过滤。

将保留在32μm的细胞团在1000r/min下离心5次后，沉淀物用于体细胞胚诱导。

诱导培养基：

MS,加入5mmol/L的Ca2+有利于胚胎发生。

每10~18d将上述悬浮培养物移入1/2MS固体培养基上使体细胞胚成苗

3）体细胞胚发生的主要阶段

体细胞胚胎发生至少经历两个阶段，即需要生长素阶段和不需要生长素阶段

形成胚性细胞团（0期）生长素→细胞缓慢增殖（1期）无激素→形成球形胚（2期）→经历心形胚、鱼雷形胚→再生植株（3期）

37、影响体胚发生的主要因素

（一）外植体

基因型往往是体细胞胚胎发生的决定因素。

一般来说，下胚轴、叶柄和贮藏根等都是较理想的外植体。

（二）生长调节物质

生长素（2,4-D）和细胞分裂素在胚性愈伤组织和体细胞胚胎发生的诱导阶段起作用，而ABA是在体细胞胚胎发育成熟阶段起作用。

（三）营养条件

常见诱导培养基：

B5、MS、SH或改良的MS。

还原型氮对胡萝卜体细胞胚的启动和成熟特别重要。

除NH4+的形式外，还原性氮还有多种形式，如椰子汁、水解酪蛋白以及多种氨基酸等。

金属离子在胡萝卜体细胞胚胎发生的过程中也是一个重要的因子

（四）环境因子

①光：

胡萝卜体细胞胚胎发生过程中，完全黑暗或连续光照都能产生更正常的成熟胚。

高强度的白光、蓝光抑制胡萝卜悬浮细胞的体细胞胚的发生和生长，而红光或绿光条件下体细胞胚的产率最高。

②细胞密度：

悬浮培养的细胞密度会影响体细胞胚发生的频率。

高细胞密度（105个/ml）是单细胞形成胚性细胞团所必需的，而较低密度（2×104个/ml）对胚性细胞团发育成体细胞胚更有利。

③气体：

生物反应器中培养的胡萝卜细胞，氧气浓度强烈地影响着随后的体细胞胚胎发生。

20％~40％的氧气浓度能大大提高鱼雷形胚和子叶形胚的产生频率。

当氧气浓度增加到7％时，心形胚产生的量就会增加，但浓度超过20％时无显著变化。

④发育的同步性：

为了一次性获得大量的体细胞胚，必须使发酵罐里悬浮培养的体细胞胚胎处于相同的发育时期。

通过不断的筛选和密度梯度离心以及优化培养条件可解决胡萝卜体细胞胚同步发育的难题，实现从单细胞到再生完整植株的同步化。

38、兰花无性快繁程序及组培过程中关键技术。

一、外植体选择

兰花的茎尖、叶片（应选择带有嫩叶的花梗）、花器官、种子等都可作为外值体用于组织培养、诱导再生植株。

二、外植体的消毒和接种

（一）外植体的消毒

在兰花茎尖组织培养中，首先从生长健壮的植株上切取约10cm长的茎尖，去掉苞叶，经过常规的消毒后备用。

（二）外植体的接种

①茎尖生长点的剥取

在超净工作台上，借助体视显微镜，用镊子将消毒茎段的幼叶剥下，露出生长点后，用解剖刀切取0.5~0.8mm大小的芽〈应尽量小，以利脱毒），接种于培养基上。

②叶片外植体的切取

从茎段切下的幼叶连同花梗上的幼叶一起，在无菌条件下切割成0.3~0.5cm2的小片，接种到培养基上。

培养基：

诱导茎尖形成原球茎：

MS或B5＋NAA0.5-1.0mg/L＋6-BA0.1~1.0mg/L＋椰子汁10%；

诱导叶片形成原球茎：

改良Kyoto＋NAA0.lmg/L＋6-BA1.0mg/L十肌醇100mg/L十烟酸0.lmg/L＋维生素B10.05mg/L十腺嘌呤20mg/L十蔗糖2%十尿素0.2%；

原球茎生芽：

1/3~1/2MS或3/4~4/5B5，其余成分与诱导原球茎形成的培养基相同。

三、原球茎的诱导

茎尖生长点或叶片接种在原球茎诱导培养基上。

凡原球茎切口处不变褐或变褐物质排出量较少的种类，可用固体培养基，而易变褐的种类，最好用液体培养基。

四、种子的无菌发芽

（－）种子灭菌

可用7%漂白粉处理20min，或按常规灭菌方法进行处理。

（二）无菌培养

五、原球茎的增殖

形成的原球茎可以不断分割，进行继代培养，加速其繁殖，直到获得所需的数量为止。

继代培养所用的培养基同诱导培养，可采用固体培养或液体培养，培养条件也一样。

原球茎的生长类型：

①极易增殖型；②圆球茎增殖较慢，但易分化成苗；③分割的原球茎接种后停止生长；④转接后不枯死，经几周变褐后又形成小的原球茎。

六、苗的分化培养与移栽

较大的兰花个体才便于移栽，新形成的小苗必须移人较大的培养容器内生长到一定大小时才能移栽。

一般是将1cm高的幼苗转移到壮苗培养基上培养3~6个月，使其长到约10cm高，方可移栽。

兰花的组织培养几个关键问题

（一）培养基的选择

常用的为MS培养基。

基本培养基的选择不是关键问题，关键是离子浓度，一般用较低的离子浓度，且注意不同培养阶段要求不同。

（二）材料的褐变

防止材料变褐是兰花组织培养成功的关键。

2,4-D的使用、灭菌技术和培养中的温、光条件对褐变都有影响。

防止褐变的方法主要是采取降低培养基中的离子浓度和采用液体培养基，也可向培养基中加入维生素C、半胱氨酸等抗氧化剂，以减轻褐变。

（三）原球茎球状体的苗分化

原球茎球状体一般可分化成苗，但有些种往往不分化出苗，或者产生畸形苗。

除了品种的差异外，培养条件也很关键，可向培养基中添加香蕉汁、椰子汁等植物组织提取物，或添加一定浓度的IAA、KT、NAA等，或降低培养基的离子浓度来加以调整。

（四）变异

兰花组织培养中的变异原因主要与高浓度的激素、长期继代培养、主芽的部位和大小、自身的芽变等有关。

要慎重选择外植体、培养基、培养条件，在继代和扩繁过程中应及时淘汰那些变异材料，保留正常的材料。

利用兰花组织培养变异的特性，可以从中选育出新的优良兰花品种。

39、柑橘花药培养过程及影响因素。

1.花药的选择与处理

摘取花药发育期为单核靠边期的花蕾，3~4℃预处理5~10d，在无菌条件下取出花药，除去花丝，将花药接种于培养基上培养。

2、花药培养：

①固体培养法。

将花药培养在固体或半固体培养基上，诱导愈伤组织或胚状体。

②液体培养法。

将花药培养在浅层液体培养基（2~3mm）中，使其漂浮在液面，定期更换培养基。

可在培养基中加入葡聚糖，使培养基密度加大，防止花药下沉。

③滤纸桥培养法。

在液体培养基中放入一无菌滤纸，花药接种在上面。

此方法透气性好，培养效果佳。

培养基成分为MS基本培养基附加1.0~2.0mg/L6-BA、0.05~0.2mg/L2,4-D、5~10%蔗糖

3、植株再生：

形成的花粉胚状体转入N6基本培养基附加0.1~0.2mg/LIBA、0.lmg/LIAA、500mg/LLH、5~10%蔗糖。

培养条件为20~25℃，16h/d光照。

胚状体可发育成完整的植株。

二）影响花药培养的因素

1、材料的选择

柑橘花药培养的效果因基因型不同而有显著差异，目前只有四季橘、苏柑、枳壳和宜昌橙杂种获得成功。

初花期花蕾中的花药比末花期的培养效果好。

2、花蕾低温处理效应

花蕾低温预处理对花粉胚的发育有促进作用。

3、生长调节剂和蔗糖浓度

当6-BA与2,4-D配合使用，即6-BA浓度为1.0~4.0mg/L、2,4-D浓度为0.05~0.2mg/L时，适于花粉胚的发育。

而当2,4-D浓度超过1.0mg/L时，则促进愈伤组织形成，无胚状体出现。

4.温度

四季橘花药在20~25℃光照培养条件下出现胚状体，当温度超过26℃时，无胚状体形成。