基础科学环境微生物实验指导书叶劲松.docx
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基础科学环境微生物实验指导书叶劲松
《环境微生物学》
实验指导书
叶劲松编
合肥学院生物与环境工程系
2010年8月
目录
实验室规则3
实验一空玻璃器皿的洗涤、包装和灭菌，无菌水的制备5
实验二培养基的制备和灭菌9
实验三微生物计数、分离培养12
实验四光学显微镜使用、微生物形态观察和染色技术20
实验五环境表面卫生学指标的测定和特定功能微生物的筛选24
实验室规则
1）实验室是办学的基本条件之一，是师生进行科学实验、开展教研科技活动，培养实验能力的重要场所。
进入实验室要自觉遵守纪律不得喧哗吵闹，保持肃静，有秩序地入座。
2）实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。
3）实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。
完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室。
4）实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。
公用试剂用完后，应立即盖严放回原处。
勿使试剂、药品（尤其是NaOH）洒落在天平、实验台面和地上。
毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。
实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。
5）配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，不得丢弃。
6）配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。
7）配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。
电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。
8）使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。
使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。
仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。
9）实验室内严禁吸烟、饮水和进食，严禁用嘴吸移液管和虹吸管。
易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。
10）实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。
11）每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，并进行赔偿。
12）实验室内严禁吸烟！
加热用的电炉应随用随关，严格做到：
人在炉火在，人走炉火关。
乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。
实验完毕，应立即拨去电炉开关和关好水笼头，拉下电闸。
离开实验室以前应认真、负责地进行检查水电，严防发生安全事故。
13）要精心使用和爱护仪器，如使用分光光度计时，不能将比色杯直接置于分光光度计上，并注意拿放比色杯时，不要打碎。
仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。
14）实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。
15）每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。
值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作。
16）根据原始记录，独立完成实验报告。
实验一空玻璃器皿的洗涤、包装和灭菌，无菌水的制备
目的
1.掌握玻璃培养皿、吸管、试管和三角烧瓶、载玻片和盖玻片等的洗涤、包装和灭菌。
2.了解无菌水的制备原理。
3.了解干、湿热灭菌的原理及应用范围。
原理
清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先觉条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。
微生物实验要求无菌条件相当严格，因此器皿需要包装，以防后来染菌。
采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。
灭菌是要进行微生物纯培养的需要。
实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。
高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。
高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。
湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。
湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。
此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。
仪器和材料
1.玻璃器皿
培养皿、吸管、试管、三角烧瓶、载玻片、盖玻片
2.仪器
高压灭菌锅、电热烘箱
3.溶液
2％的煤酚皂溶液（来苏尔）或者0.25％新洁而灭消毒液
4.其它
洗衣粉或洗涤剂、牛皮纸、报纸、细绳、纱布、普通棉花、细铁丝（牙签）、试管刷、吸耳球、剪刀、试管硅胶塞、三角瓶硅胶塞等
实验内容
一.玻璃器皿的洗涤和包装
1．洗涤
（1）培养皿、试管、锥形瓶和烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗刷剂刷洗，然后用自来水充分冲净干净。
移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。
装有固体培养基的器皿应该先将其刮去，至垃圾桶中，然后洗涤。
带菌的器皿在洗涤前先浸在2％的煤酚皂溶液（来苏尔）或者0.25％新洁而灭消毒液内24小时或者煮沸0.5小时，再用上法洗涤。
带病原菌的培养物应该先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。
盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可以使用。
如需要精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，在自来水洗涤干净后，再用蒸馏水洗涤三次。
洗刷干净的玻璃器皿放架台自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。
（2）玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（含毛细吸管），使用后应该立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（底部应该垫以脱脂棉花，防止投入时损坏），免得干燥后难以洗涤，待实验完毕后集中冲洗。
如吸管顶（尾）部塞有棉花。
则冲洗前，先将吸管尖端与装在自来水头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出来。
（3）载玻片和盖玻片用过的载玻片和盖玻片，如滴有香柏油，则
a.要先用皱纹纸擦净或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，
b.再在肥皂水中煮沸5－10分钟，
c.用软布或脱脂棉擦净，
d.立即用自来水冲洗，
e.然后在稀洗涤剂中浸泡0.5-2小时，
f.自来水冲洗去洗涤剂，
g.然后用蒸馏水换洗数次，
h.待干燥后浸于95％的乙醇中保存备用。
使用时在火焰上烧去乙醇。
检查过活菌的载玻片和盖玻片应该先在2％的煤酚皂溶液（来苏尔）或者0.25％新洁而灭消毒液内24小时，然后按照上法洗涤和保存。
2．包装
（1）培养皿的包装一般5-8套培养皿做一包，用报纸密密包紧。
包好后干热或者湿热灭菌。
如有装培养皿的金属筒，则不必包装。
（2）移液管的包装在距其粗头顶端约0.5cm处，用细铁丝（牙签）将少许棉花（勿用脱脂棉）塞入构成1－1.5cm长的棉塞。
将塞好棉花的移液管的尖端，放在4－5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条成30-45度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式包在移液管外面，余下纸头折叠打结。
很多吸管用一大张报纸包好，进行干或湿热灭菌。
如有装吸管的金属筒，可以将包好的吸管一起放入筒内，进行灭菌。
如果预计一次灭菌的吸管可以一次用完，可以不用报纸包而直接装入筒内灭菌。
但是吸管尖端要朝向筒底，使用时，筒卧放，手将粗端抽出。
（3）试管和三角烧瓶等的包装用棉塞将试管口和锥形瓶瓶口部塞住，然后再在棉花塞和管口或瓶口的外边，用两层报纸或牛皮纸与细线包扎好。
棉塞的制作：
方法一：
大小、厚薄适中的普通棉花（虽然脱脂棉质量较好，纤维细长，有利于棉塞的制作，但是脱脂棉最容易吸收空气中的水分而使棉花受潮，棉塞受潮后，用来封闭试管或三角瓶，空气中的微生物就会沿湿润的棉塞进入，引起杂菌污染。
）一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。
方法二：
①按试管或锥形瓶的大小，取适量棉花铺成近正方形，中间稍厚，边缘稍薄。
②折角：
将近方形棉花的一角往里折，略成五边形，然后从一侧往另一侧卷紧。
③整理：
使边缘的棉花起缚线的功能，勿使棉卷松开，并使外形像未开伞的蘑菇。
方法三：
如下图所示
棉塞的直径和长度视试管和锥形瓶的大小而定，一般约1/3塞入管内。
必须做到松紧合适、紧贴管壁，拔出时不松散、不变形。
现有一些市售的棉塞的替代品，如硅胶塞、塑料（耐高温）或不锈钢的套管等，均可使用。
二.干湿热灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。
1．加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为止。
注意
切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2．装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。
装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。
3．加盖将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；
4．排气加热．待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。
一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。
注意
灭菌的主要因素是温度而不是压力。
因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5．升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。
6．保压当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。
开始计时并维持压力至所需时间。
本实验用121℃，20min灭菌（含糖培养基用0.56kg∕cm2的压力）。
7．降压达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。
放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。
注意
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。
否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
8．无菌检查将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。
干热灭菌法
干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；
1．装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。
2．升温关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度（本实验所需为160～170℃），此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。
3．恒温当温度升到所需温度后，维持此温度2h。
4．降温切断电源，自然降温。
5.取出灭菌物品待电烘箱内温度降到70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。
注意
1．使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。
2．干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触．以免包装纸烤焦起火。
三.无菌水制备
1.在每个250mL的锥形瓶内装99mL的蒸馏水，放入30粒玻璃珠于锥形瓶内，并且塞上棉塞。
2.在每试管内装9mL蒸馏水，塞上棉塞或塑料试管盖。
再在棉塞外包上一张牛皮纸。
高压蒸汽灭菌，0.1MPa，20min。
实验报告
1.结果
1．记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
2．试述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项。
2.思考题
1．高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?
实验二培养基的制备和灭菌
目的
1.了解培养基的配置原理。
2.掌握培养基常规配制程序。
基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。
基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。
其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。
在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。
琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH凋至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏3.0g
蛋白胨10.0g
NaCl5.0g
水1000mL
pH7.4-7.6
仪器和材料
1．玻璃器皿
培养皿（直径90mm），试管（15mm╳150nm），（18mm╳180mm）支，移液管（10mL），锥形瓶（250mL），烧杯（300mL）、量筒、玻璃棒
2.药品
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、或市售营养琼脂培养基、蒸馏水
3.试剂
精密PH试纸6.4-8.4、1mol/LNaOH,1mol/LHCl.
4.仪器
电磁炉、天平、鉄架、漏斗、乳胶管、弹簧荚、玻管（1mL枪头）
5.其它
药勺、称量纸、记号笔、试管棉塞、三角瓶棉塞、牛皮纸、报纸、线绳、
实验内容
（一）培养基的制备
1.称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
注意：
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。
瓶盖也不要盖错。
2.溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网（电磁炉）上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。
将药品完全溶解后，补充水倒所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在制备用三角烧瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％～2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化和灭菌同步进行，节省时间。
注意：
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。
配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。
1.调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。
反之，用1mol/LHCL进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法、可参考有关说明书）。
注意：
pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。
因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。
4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。
一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
分装装置见下图。
⑴液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
⑵固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后趁热适当倾斜制成斜面。
分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
⑶半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等）。
以阻止外界微生物进入普及内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
三角烧瓶加塞后，外加牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。
）
8．灭菌
将上述培养基以0.103Mpa，121℃，20min高压蒸气灭菌。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜（见下图）。
10．无菌检查
将灭菌培养基放入37℃的温室总培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。
培养基分装斜面制作
（五）灭菌
实验报告
思考题
1.培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？
实验三微生物计数、分离培养
实验目的
1.掌握环境中分离培养微生物的方法，获得若干种微生物纯培养技能。
2.掌握稀释平板计数和显微镜直接计数方法。
基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
纯培养的确定：
确定其菌落观察特征；结合显微镜检测个体形态特征的确定。
平板菌落计数法是将待测样品适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经培养，由每个单细胞生长繁殖而成的肉眼可见的菌落。
统计菌数，根据稀释倍数和取样接种量即可算出样品中含有效菌数。
但，由于待测样品往往不易分散成单个细胞，长成的单个菌落可能来自样品中2-3个或更多细胞。
因此平板计数法往往偏低。
为了清楚阐述平板菌落计数法的结果。
现在已倾向使用菌落形成单位而不以绝对菌落数表示样品的活菌含量。
显微镜直接计数法时将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快捷、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：
血细胞计数板，Peteroff-Hauser计菌器和Hawksley计菌器等，他们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
本实验采用的是常用的血细胞计数板（也称血球计数板）。
血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。
仪器和材料
1.菌源：
堆肥样品
2.培养基：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
3.溶液和试剂：
500mL无菌水、装有10颗玻璃珠的250mL的无菌三角瓶、装有9mL无菌水的试管。
4.仪器：
天平、无菌药勺、无菌碾钵（含杵头）、无菌量筒（100mL）、无菌玻璃涂棒、无菌移液管（1mL）、无菌培养皿（90mm）、接种环、显微镜、盖玻片、试管架、酒精灯等。
实验内容
纯种分离
纯种分离的方法有两种：
稀释涂布平板（含浇注平板法）和平板划线法
（一）稀释涂布平板分离法
1．倒平板
将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个平皿约15mL培养基，凝固即成平板。
取对照的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于40℃培养24－48h后观察结果。
倒平板方法如下图所示
倒平板
a:
皿加法b:
手持法
2．菌源取样：
用无菌锥形瓶到堆肥现场取一定量的样品，迅速带回实验室。
3．稀释菌液制备：
将10管9mL的无菌水排列好，按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9和10－10依次编号。
在无菌操作条件下，取10克堆肥样品，碾钵中碾碎，用无菌水总计90mL反复冲洗，转入250mL无菌三角瓶，摇晃使菌液均匀。
再用1mL的无菌移液管吸取1mL稀释菌液置于10－1试管中，将移液管吹洗三次，即为10－1浓度的菌液。
然后，再用1mL无菌移液管吸取1mL10－1浓度的菌液于10－29mL试管无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2浓度菌液。
同样方法，依次稀释到10－10。
注意：
在稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。
4．涂布
取10套无菌培养皿编号，10－7、10－8、10－9各三个，另一个为空气对照。
取一支1mL无菌移液管从浓度小的10－9菌液开始，以10－9、10－8、10－7为序，分别吸取0.1mL菌液于相应编号的培养基平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀。
在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度。
稀释涂平板完毕，合上且标记空气对照培养皿。
注意：
每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀。
此法接种量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，先正摆20-30min等水分蒸发后倒置。
不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
也可采用如下浇注稀释分离方法：
先加入0.2mL菌液到平皿内，然后当培养基加热融化冷至45-50℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于40℃培养24-48h，然后观察结果。
取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于40℃培养24-48h后观察结果。
倒置于40℃培养箱24－48h，然后观察记录结果。
5.挑菌落
将长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到斜面上，置于40℃培养，待长出菌苔后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。
如发现有杂菌，需要再一次分离纯化，直到得到纯培养。
稀释分离法
（二）平板划线分离
1．倒平板
同上，稀释平板分离方法
2.划线分离
在近火焰处，用接种环挑取菌悬液一环，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环深入培养皿内，在平板上轻轻划线。
划线完毕后盖好皿盖，倒置，40℃培养24－48h后观察记录结果。
划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
划线的方式可取图中任何一种。
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
接种技术
由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，现简介如下：
（－）接种用具
常用的接种用具有接种环、接种针、接种钩、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。
接种环和接种针等总长约25c
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