注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。
1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。
*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。
根据自己需要调节。
EDTA用NaOH滴定。
Protocol
1调制proteinAsapharose
proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存
用单抗做一抗时，把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理（每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清）。
旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s
去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次
加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。
避免长期保存。
2．抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行
去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。
加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。
RIPA的量：
6cm的培养皿加1ml（蛋白质的量为500mg/ml）,组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
30m，15000rpm离心，上清转移到新tube。
不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h
加proteinAsapharose50ul，再混匀1h
5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。
往sapharose加RIPA，vortex混匀，离心，去上清。
重复4次洗净。
加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
3.注意点
A：
不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。
对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：
对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。
（完）
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免疫共沉淀原理及实验方法
[SPANclass=javaid=text9766]免疫共沉淀[BR]一原理：
[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。
[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
[BR][BR]其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
[BR][BR]再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
[BR][BR]每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
欲速则不达，确定好比例很必要。
（待续）[BR]二准备：
[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体（单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清）[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinAsapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液（最终浓度）[BR]1MTris-HCL（PH7.4）5ml（10mM）[BR]5MNacl15ml（150mM）[BR]0.5MEDTA（PH7.4）5ml（5mM）[BR]20%TritonX-10025ml（1%）[BR]10%DOC50ml（1%）[BR]10%SDS5ml（o.1%）[BR]TLCK18.5mg（0.1mM）[BR]TPCK35mg（0.2mM）[BR]DDW395ml[BR]toal500ml[BR]另外，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。
注意不易溶于水）[BR]2.NP40lysis缓冲液[BR]1MTris-HCL（PH7.4）5ml（10mM）[BR]5MNacl15ml（150mM）[BR]0.5MEDTA（PH7.4）5ml（5mM）[BR]20%NP4025ml（1%）[BR]TLCK18.5mg（0.1mM）[BR]TPCK35mg（0.2mM）[BR]DDW450ml[BR]toal500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点：
[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。
[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。
[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC＆lt;SDS是离子性的强活性剂。
注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。
1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。
[BR]*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。
根据自己需要调节。
EDTA用NaOH滴定。
[BR]Protocol[BR][BR]1调制proteinAsapharose[BR][BR]proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时，把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理（每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清）。
旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s[BR][BR]去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。
避免长期保存。
[BR][BR]2．抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。
加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。
RIPA的量：
6cm的培养皿加1ml（蛋白质的量为500mg/ml）,组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
[BR][BR]30m，15000rpm离心，上清转移到新tube。
不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加proteinAsapharose50ul，再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。
往sapharose加RIPA，vortex混匀，离心，去上清。
重复4次洗净。
[BR][BR]加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
[BR][BR]3.注意点[BR]A：
不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。
对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
[BR]B：
对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。
（完）[/SPAN][BR]
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4.免疫共沉淀技术路线（CoIP）
2007-05-0709:
14
准备工作：
预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2.加入预冷的RIPABuffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）
3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）
4.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中
5.准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6.每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景
7.4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子
8.（Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：
10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）
9.用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10μg/μl）
10.加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育
12.加入100μlProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）
13.14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800μl/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS
14.用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60μl足够上三道）
15.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
RIPABuffer配制：
基础成分：
Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）
注意：
准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）
EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
RIPA磷酸（酯）酶抑制剂
激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见SodiumOrthovanadateActivationProtoco）
NaF（200mM的储存液，室温保存）
注意：
在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制：
配制100ml的modifiedRIPAbuffe：
1.称取790mg的Tris-Base，加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4
2.加10ml10%的NP-40
3.加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4.加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5.理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100µl;PMSF,Na3VO4,NaF各500µl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
•Tris-HCl:
50mM,pH7.4
•NP-40:
1%
•去氧胆酸钠：
0.25%
•NaCl:
150mM
•EDTA:
1mM
•PMSF:
1mM
•抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂:
各1µg/ml
•Na3VO4:
1mM
•NaF:
1mM
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1．用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min。
3．收集上清（约30ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h。
4．加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min。
5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。
8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min。
10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
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