罗丹明BMn2+H2O2体系同步荧光分光光度法Word下载.docx
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本文采用罗丹明B作指示剂，在Mn2+-H2O2体系产生羟自由基（·
OH），测定水果的抗氧化活性。
从常见水果中寻找抗氧化剂，充分利用丰富的水果资源，具有实际意义。
2测定原理
传统的Fenton反应是用Fe2+-H2O2体系产生羟自由基。
本文研究发现，Mn2+亦可与H2O2作用，类似Fenton反应产生羟自由基，产率比FeSO4还要高，其反应原理可类推如下:
Mn2++H2O2→Mn（Ⅲ）+·
OH+OH-
Mn（Ⅲ）十H2O2→Mn（IV）+·
OH+OH-
然后，利用羟自由基迅速氧化罗丹明B，使罗丹明B的荧光强度显著降低，降低程度随羟自由基的增加而加大，从而间接测定羟自由基的产生量。
而水果提取物可以部分清除溶液中的羟自由基，从而使其荧光猝灭程度减弱，据此可以测定水果抗氧化性。
3实验部分
3.1主要仪器与试剂
3.1.1主要仪器
F-4600型分子荧光分光光度计日本日立公司
SQ2119多功能食品加工机上海帅佳电子科技有限公司
TD4台式离心机湖南仪器表总厂离心机长
电子分析天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司
PHSJ-3F实验室pH计上海精密科学仪器有限公司
3.1.2主要试剂
MnSO4·
H2O（含量不少于99%）天津市北方天医化学试剂厂
抗坏血酸（含量不少于99.7%）天津市福晨化学试剂厂
H2O2（含量不少于30%）天津市凯通化学试剂有限公司
罗丹明B天津市津科精细化工研究所
氯化铵（含量不少于99.5%）天津市津东天正精细化学试剂厂
氨水（含量不少于25%-28%）天津市赢达希贵化学试剂厂
所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
3.2储备液的配制
干燥的小烧杯若干，100mL容量瓶3只，1000mL的容量瓶1只，聚乙烯塑料瓶，500mL容量瓶两只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只，2mL移液管4只，贴上标签（罗丹明B，Mn2＋，H2O2，buffer。
），100ml量筒一只，10mL移液管两只（缓冲）
3.2.1硫酸锰储备液的配制
准确称取MnSO4·
H2O（M=169）0.3397g，在小烧杯中用少量水溶解转移100mL容量瓶中定容，配制成20mmol/L溶液作为储备液。
实验所用的浓度是2mmol/L，移取10mL20mmol/L储备液于100mL的容量瓶中定容至刻度。
3.2.2罗丹明B储备液的配制
准确称取罗丹明B0.01g左右，在小烧杯中溶解，转移定容在1000mL的容量瓶中，配成1×
10-2g/L的储备液。
3.2.31%双氧水储备液的配制
移取30%H2O23mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87mL的蒸馏水（都用量筒）。
3.2.4.0.1mol/L氨水储备液的配制
准确移取3.33mL浓氨水，稀释至500mL的容量瓶中，定容至刻度，转移在500mL的细口瓶中，配置成0.1mol/LNH3·
H2O的储备液。
3.2.5.0.1mol/L氯化铵储备液的配制
准确称取2.675g左右氯化铵（M=53.49），在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在500mL的容量瓶中，转移在500mL的细口瓶中，配置成0.1mol/LNH4Cl的储备液。
3.2.6根据化学手册配制成不同pH值NH3-NH4Cl缓冲溶液：
0.1mol/LNH4ClV/mL
32
30
25
15
0.1mol/LNH3·
H2OV/mL
1
4
pH
8.0
8.58
9.1
9.5
9.8
10mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！
3.2.7抗坏血酸储备液的配制
准确称取抗坏血酸0.3523g，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在100mL的容量瓶中，得到20mmol/L的储备液。
实验时，移取2.5mL20mmol/L的抗坏血酸，转移定容在100mL的容量瓶中得到0.5mmol/L的抗坏血酸。
3.3实验方法
3.3.1羟自由基的测定
在10mL容量瓶中，pH9.8的缓冲溶液1.0mL，加入1Χ10-2g/L的罗丹明B1.6mL，2.0mmol/L的Mn2+溶液2.0mL，1%的H202溶液1.0mL，加蒸馏水至刻度，混匀。
测定579nm波长处的荧光强度F，计算其与空白参比（罗丹明B与缓冲液）荧光强度F0之差△F，通过测定·
OH形成前后罗丹明B的荧光强度变化，来反映·
OH的产生量。
3.3.2羟自由基清除率的测定
在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂，同样操作侧定荧光强度Fs;
罗丹明B和缓冲溶液作为空白体系，其荧光强度为F0，未加清除剂的体系，其荧光强度为F，则清除率=（Fs-F）/（F0-F）×
100%
3.3.3水果水提取物清除·
OH的作用
新鲜水果洗净，晾干，准确称取20g，加入200mL蒸馏水，匀浆3min，过滤，离心5min，取上层清液0.6mL按上述方法进行测定。
4结果与讨论
4.1.荧光光谱
罗丹明B本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为553nm和579nm，
1、罗丹明B+缓冲溶液
2、罗丹明B+缓冲溶液+Mn2++H2O2+抗坏血酸
3、罗丹明B+缓冲溶液+Mn2++H2O2
图1荧光光谱
4.2实验参数
工作模式：
发射扫描扫描间隔：
2nm激发狭缝:
6nm
发射狭缝：
6nm负高压：
130V
4.3实验条件
实验条件对羟自由基的产生有影响，也对抗氧化剂对羟自由基的清除率有影响，应综合考虑这两方面的因素，选择适宜的测定条件。
4.3.1酸度的影响
强酸性介质中罗丹明B基本无荧光，弱酸性介质中罗丹明B的荧光很弱，碱性介质中，罗丹明B发强荧光，空白和羟自由基体系的△F受pH值的影响如图2所示。
可以看出，在pH=9.8时△F有较大值，故选用弱碱性介质pH9.8的缓冲溶液。
缓冲各1mL（pH=）
罗丹明B（1×
10-2g/L）/mL
1.6
Mn2+（2.0mmol/L）/mL
2
H2O2（1%）/mL
0.8
1’
2’
3’
4’
5’
罗丹明B（8×
10-4g/L）/mL
ΔF
12.2
-2.6
71
78.2
92.7
图2
4.3.2罗丹明B的用量
加入不同体积1×
10-2g/L罗丹明B溶液，按试验方法测定空白体系和·
OH体系的△F，如图3所示，结果表明罗丹明B用量为1.6mL。
缓冲（pH=9.8）/mL
1.2
1.4
1.8
缓冲（pH=9.8）/mL
罗丹明B（8Χ10-4g/L）/mL
72.9
71.7
71.1
101.5
85.5
图3
4.3.3硫酸锰的用量
按实验方法加入不同体积2mmol/L的MnSO4溶液，测定荧光强度，如图4所示，选用MnSO4溶液为2.0mL。
59.1
55.3
64.8
81.7
10-2g/L）/mL
图4
4.3.4过氧化氢的用量
用不同体积1%的H2O2按试验方法测定荧光强度，如图5所示，本实验选用H2O2溶液1.0mL。
2.0
0.6
1.0
82.4
83.7
115.6
87.0
114.4
图5
4.5抗氧化剂清除羟自由基作用的测定
于体系中加入抗坏血酸，按试验方法测定空白体系的F0，·
OH体系的F，加清除剂体系的Fs。
荧光强度变化如图1所示，结果表明，随抗坏血酸用量增加，清除率加大。
说明本体系中抗坏血酸与·
OH的清除作用有明显的量效关系。
4.6水果的抗氧化作用
测定了4种新鲜水果的水提取物对·
OH的清除率，结果见表2。
从表中看出橙子、苹果具有较强的清除·
OH的功能。
清除率=（Fs—F）/（Fo—F）×
表2各种水果的清除率
水果
清除率（%）
梨
31.92
橙子
38.75
猕猴桃
31.57
苹果
39.1
5结果讨论
从这次实验中可以看出水果盘蔬菜中含有大量天然抗氧化剂、且提取率高、抗氧化活性强，其与机体亲和力强和安全性高等优点具有取代合成抗氧化剂趋势，是今后的研究重点。
另外，天然抗氧化剂尚需在有效成分的抗氧化机理、协同作用、构效关系和分子设计等方面开展深入研究，为天然植物开发抗氧化剂的应用奠定理论基础；
同时要加强天然植物原料提取、分离纯化有效成分工艺研究，以尽快实现天然抗氧化剂的产业化。
参考文献：
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体系荧光法测定常见水果的抗氧化活性.分析科学学报.2005.2.第21卷第1期
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