菊花花瓣的组织培养.docx
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菊花花瓣的组织培养
菊花花瓣的组织培养
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生命科学与化学学院
生物技术试验班
20080403801005壳壳来了
指导老师:
2010年9月13日至11月19日
目录
摘要…………………………………………………………………..4
关键词………………………………………………………………..4
前言…………………………………………………………………..4
§1实验材料…………………………………………………………5
1.1实验材料………………………………………………………...5
§2菊花外植体的制备........................................................................5
2.1药品……………………………………………………………...5
2.2物品器材………………………………………………………...6
2.3方法……………………………………………………………...7
2.3.1MS培养基的配制…………………………………………7
2.3.2灭菌………………………………………………………...7
2.3.3加激素和外植体的消毒…………………………………...7
2.3.4菊花花瓣接种……………………………………………...7
2.3.5培养………………………………………………………...7
2.4后续………………………………………………………………7
§3.菊花的分化培养………………………………………………….7
3.1试剂………………………………………………………………8
3.2灭菌的物品………………………………………………………8
3.3方法………………………………………………………………8
3.3.1MS培养基的配制…………………………………………8
3.3.2加激素和分化……………………………………………...8
3.3.3培养………………………………………………………...8
3.4后续………………………………………………………………8
§4.菊花的生根培养………………………………………………….8
4.1试剂……………………………………………………………....8
4.2灭菌物品…………………………………………………………8
4.3方法………………………………………………………………8
4.3.1MS培养基的配制…………………………………………8
4.3.2加激素和分化……………………………………………...8
4.3.3培养…………………………………………………….......8
4.4后续………………………………………………………………8
§5结果与讨论……………………………………………………….8
§6实验建议………………………………………………………….11
主要参考文献………………………………………………………..12
摘要:
述菊花花瓣组织培养的备件、生长与分化情况及意义。
关键词:
无菌操作、菊花、花瓣、组织培养。
前言：
植物组织培养（tissueculture）是二十世纪初兴起的一项高新生物技术，至今已经有一百多年的历史，如今已成为了生物领域里面十分活跃的技术。
植物组织培养开始走上工厂化和商业化始于20世纪六十年代，得利于花粉小孢子培养和原生质体培养的成功。
和植物组织培养的历史相比，中国的在这方面的研究起步算是比较早的，在二十世纪四十年代在这方面就有所研究，但是大范围的发展起来还是始于二十世纪七十年代的花药培养。
植物组织培养的概念是指在人工控制的条件下，将植物体的任何一部分，或器官、或组织，或细胞，进行离体培养，使之发育形成完整的植物体。
所谓人工控制的条件，即营养条件和环境条件；植物体的任伺一部分是指根、茎、叶、花、果以及它们的组织切片和细胞。
它的优越性在于：
可以在不受其他部分干扰的情况下研究被培养部分的生长和分化规律。
特点是：
取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。
植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性（totipotency）。
一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成完整植株，这就是所谓的细胞全能性。
植物组织培养的基本方法是材料选择、培养基配置、接种与培养和最后的小苗移栽。
植物组织培养的应用1、植物离体快速繁殖
2、植物脱毒苗木培育
3、植物新品种培育
4、植物次生代谢产物生产
6、人工种子
5、植物种质资源的离体保存
国内外研究进展1植物组织培养的光源研究早在1991年，维斯康星大学的Bula等利用以红光660nm为发光中心的GAALASLED阵列及其辅助光蓝色荧光灯，栽培了GRANDRapidslettace（lactucasativaL），这大概是世界上最早利用LED作为光源进行植物栽培的试验实例。
经LED光源处理的组培苗鲜重增量、碳酸酐酶活性以及叶绿素含量等明显高于对照的日光灯处理组培苗。
2无糖组织培养技术研究无糖组织培养是日本千叶大学古在丰树教授研究开发的一种新的植物组培技术。
他首先研究发现容器
中的小植株也具有光合自养能力，从而考虑改变植株的营养方式以CO2作为植株的碳源，同时改善植株的生理和能量代谢，使植株更好地发挥自身的光合能力，降低生产成本。
3植物组织培养的新型培养容器研究在传统的组织培养中，通常采用容积较小的培养容器以降低培养基中糖引起的污染，一般情况下容器中的空气流动性差，相对湿度高，CO2浓度低。
为了增强培养容器内外的气体交换、降低容器内的相对湿度，近年来有不少学者研究了利用高分子膜材料制成的培养容器的有效性。
1.实验材料
材料：
在武汉大学某花鸟市场购买的菊花，菊花花瓣呈白色，取里层花瓣切块后接种于平底试管。
2.菊花的外植体的制备
2.1药品：
0.1mg/mlNAA,1mg/ml6-BA,储备液ⅠⅡⅢⅣ
MS培养基及其储备液（mg/L）
全班分小组配制储备液量:
Ⅰ1L;Ⅱ2L;Ⅲ200ml;Ⅳ200ml
培养基
储备液
NH4NO3
1650
Ⅰ
20×
33000
KNO3
1900
38000
CaCl2.2H2O
440
8800
MgSO4.7H2O
370
7400
KH2PO4
170
3400
KI
0.83
Ⅱ
200×
166
H3BO3
6.2
1240
MnSO4.4H2O
22.3
4460
ZnSO4.7H2O
8.6
1720
Na2MoO4.2H2O
0.25
50
CuSO4.5H2O
0.025
5
CoCl2..6H2O
0.025
5
FeSO4.7H2O
27.8
Ⅲ
200×
5560
Na.EDTA.2H2O
37.3
7460
肌醇
100
Ⅳ
200×
20000
烟酸
0.5
100
烟酸吡哆醇
0.5
100
盐酸硫胺素
0.1
20
甘氨酸
2
400
2.2灭菌物品:
平底试管9支,蒸馏水200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板9个,一套枪头。
其他器材:
酒精灯,打火机,废液缸,移液枪一套,篮筐，棉塞，棉线，超净台，称量纸，锥形瓶250ml，玻璃棒，报纸。
2.3方法:
2.3.1MS培养基的配制：
先称取琼脂1.4g，蔗糖6g于250ml锥形瓶中，再加150ml蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。
溶解后在锥形瓶中加储备液Ⅰ10ml，储备液Ⅱ1ml，储备液Ⅲ1ml，储备液Ⅳ1ml，然后加水到200ml，用HCl或NaOH，调PH至5.8。
最后趁热分装于9支平底试管，棉塞封口。
2.3.2灭菌:
用高压蒸汽灭菌锅将上述物品灭菌,在121℃灭菌15min。
2.3.3加激素和外植体的消毒：
在超净工作台上，趁热在每支试管加20ul6-BA和20ulNAA，取菊花花瓣,用自来水洗2-3次，置于小烧杯中，用体积分数为70%的乙醇浸泡15-30s。
用无菌水清洗2-3次后，用质量分数为2%的次氯乙酸钠液中浸泡6-10min，用无菌水洗3-4次。
于灭菌过的培养皿上切成0.5×0.5大小的方块。
接种到平底试管诱导培养基中。
2.3.4菊花花瓣接种：
插入菊花瓣,要注意使花瓣的形态学下端接触到培养基.每瓶接种5瓣,接种后将锥形瓶的瓶口在酒精灯火焰处转动灼烧一遍。
重新包扎封口，贴上标签。
2.3.5培养：
将接种后的9支平底试管放在30℃恒温室培养。
20天左右就可以形成愈伤组织。
2.4后续：
收拾台面，处理废弃物。
3.菊花的分化培养
3.1试剂：
6-BA1mg/ml,NAA0.1mg/ml,储备液ⅠⅡⅢⅣ
3.2灭菌的物品：
平底试管9支,蒸馏水200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板9个,一套枪头。
其他器材:
酒精灯,打火机，用镊子，废液缸,移液枪一套,篮筐，棉塞，棉线，报纸，超净台，称量纸，锥形瓶250ml，玻璃棒。
3.3方法：
3.3.1MS培养基的配制：
先称取琼脂1.4g，蔗糖6g于250ml锥形瓶中，再加150ml蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。
溶解后在锥形瓶中加储备液Ⅰ10ml，储备液Ⅱ1ml，储备液Ⅲ1ml，储备液Ⅳ1ml，然后加水到200ml，用HCl或NaOH，调PH至5.8。
最后趁热分装于9支平底试管，棉塞封口。
3.3.2加激素和分化：
在无菌操作室中,趁热在每支试管加20ul6-BA和20ulNAA。
然后用镊子取出图4中的愈伤组织，在平板上，用灭菌的蒸馏水清洗三次。
用小刀切成5×5mm的小块，用镊子放入平底试管里。
立即在酒精灯火焰处灼烧管口后塞上棉塞，报纸包扎标记。
3.3.3培养：
将9支平底试管放在20℃培养室，光照下培养，直到发芽。
3.4后续：
收拾台面，处理废弃物。
4、菊花的生根培养
4.1试剂：
NAA10mg/ml,储备液ⅠⅡⅢⅣ
4.2灭菌物品:
蒸馏水200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板9个,一套枪头。
其他器材:
酒精灯,打火机,废液缸,移液枪一套,篮筐，棉塞，棉线，超净台，称量纸，锥形瓶250ml，玻璃棒，报纸。
4.3方法：
4.3.1MS培养基的配制：
先称取琼脂1.4g，蔗糖6g于250ml锥形瓶中，再加150ml蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。
溶解后在锥形瓶中加储备液Ⅰ10ml，储备液Ⅱ1ml，储备液Ⅲ1ml，储备液Ⅳ1ml，然后加水到200ml，用HCl或NaOH，调PH至5.8。
最后趁热分装于9支平底试管，棉塞封口。
4.3.2加激素和分化：
在无菌操作室中,趁热在每支试管加1.8ulNAA。
然后用镊子取出愈伤组织，在平板上，用灭菌的蒸馏水清洗三次。
用镊子放去平底试管里。
立即在酒精灯火焰处灼烧管口后塞上棉塞，报纸包扎标记。
4.3.3培养：
将9支平底试管放在20℃培养室，光照下培养，直到发芽。
4.4后续：
收拾台面，处理废弃物。
5、菊花的移植
5.1讲生根培养基里面的菊花一直到寝室花盆。
5、结果与讨论
5.1图片结果
5.1.1菊花的诱导培养基20天后
图1图2图3
图4图5图6
图7图8图9
从上图中可以发现图5、6、9中的愈伤组织完全死亡，无明显现象。
图2、
3、6、7、8其他的生长良好,其中夹带着少许绿色组织，生长较为缓慢。
而图4则生长旺盛，脱分化出大量的愈伤组织，呈一团浓绿组织。
5.1.2菊花的分化组织基30天后
图10图11图12
可以清晰看出与10、11中的菊花分化组织生长良好,能够看到有少许的小叶片.图12试管中的菊花组织上有大量褐化的成分，颜色较淡。
5.1.3菊花的生根培养基
图5图6
从图5、6中可以清晰的看到有许多大叶片，在底部有少许根毛出现。
确定生根培养良好,可以移植在花盆。
5..2讨论5.1.1可以在实验里看到了一些组织出现了褐化现象,其中褐变是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象。
考虑到实验过程,可以发现距阿华的褐化现象可能是以下的几个方面造成的：
（2）菊花的生理状态菊花的状态不同，接种后褐变程度不同。
一般菊花的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。
（4）培养基在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变。
（5）光照在采取菊花前，将接种后的初代培养的菊花在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生也有一定的效果遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受光照影响。
但是，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。
（6）温度高温促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重，而低温可抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。
在实验途中可以有几支试管倾倒在日光灯管上，造成了温度过高。
（7）培养时间材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。
菊花随着培养时间的延长，褐变程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转接，褐变物的积累还会引起培养材料的死亡。
从可以的实验时间来看，可以的菊花的培养时间还不是很长，这个原因应该说是影响不大的。
6.实验建议:
6.1实验注意事项：
1.无菌操作是最为关键的，预备室的清洗、培养基的配制和灭菌，外植体初步处理和接种等工作要灭好菌。
2.培养室要求光照、温度控制，以利于外植体的生长、发育。
3.在菊花组织培养中试剂的配制配方要熟记，避免不必要的错误。
6.2在实验过程中老师可以控制每组的激素添加量，让全班一个大组的激素添加量形成交叉，能够横竖来比较。
因为我感觉在此次实验中，大家试管的成功率不是很理想。
参考文献:
[1]植物组培网
[2]李浚明组织培养教程2002
[3]期刊论文曾凡力.ZENGFan-li菊花花瓣的组织培养-北方园艺2007。
[4]邹英宁，李国怀．李组织培养研究进展（综述）[J]．亚热带植
物科学，2005，34（4）：
76—80.
[5]期刊论文王康才.张雪琼.茅毓英杭菊花花瓣组织培养-中草药2000,31（8）
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