PCR实验室SOP.docx

PCR实验室SOP.docx

《PCR实验室SOP.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR实验室SOP.docx（8页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

PCR实验室SOP

【】ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-011

分子生物操作手册

版本号：

B

修订号：

0

文件标题：

ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序

发布日期：

文件编号：

LAB-SOP-FZSW-011

生效日期：

编写人：

审核人：

发布部门：

中心主任：

批准人：

其他：

页码：

第1页，共4页

1.目的：

确保ABI7500仪器的正确使用及正常运行

2.适用范围：

美国应用生物系统公司生产的ABI7500实时荧光定量PCR仪

3.运行环境：

电源：

推荐配备合适的UPS或稳压器。

通风：

仪器的通风应该没有阻挡。

温度：

推荐实验室配备空调，温度应该控制在10～30℃之间。

湿度：

20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。

空间：

易于操作，安全。

4.操作程序：

4.1开关机程序：

开机顺序：

先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件，进行实验。

关机顺序：

确认实验已经结束后，首先关闭ABI7500系统软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

4.2创建绝对定量反应板文件：

4.2.1依次选择Start>Programs>AppliedBiosystems7500>AppliedBiosystems7500SDSSoftware（

），以启动SDS软件;或在桌面双击AppliedBiosystems7500SDSSoftware（

）图标。

4.2.2选择File（文件）>New（新建）。

4.2.3在NewDocumentWizard（新建文件向导）窗口中，从Assay（实验）下拉列表中选择AbsoluteQuantification（StandardCurve）（绝对定量，标准曲线）。

接受Container（反应板类型）与Template（模板）字段中的默认设置（即分别为96-WellClear（空白96孔板）与BlankDocument（空白反应板））。

4.2.4在DefaultPlateName（默认反应板名）字段中输入反应板文件名，或接受默认文件名。

4.2.5单击Next>（下一步>）。

4.2.6选择要添加到反应板文件的探针。

A）单击以选择一个探针。

（按住Ctrl键单击可选择多个探针。

）如果在DetectorManager（探针管理器）列表中未列出探针，请创建探针。

B）单击Add>>（添加>>）。

探针即被添加到反应板文件。

C）单击Next>（下一步>）。

4.2.7为每个反应孔指定探针与任务。

A）单击一个反应孔（或对于重复选择一组反应孔）以选取它（们）。

B）单击探针名，为反应孔选定探针。

C）单击Task（任务）栏的下边，以指定探针任务。

D）为包含标准样本的反应孔输入量值。

E）单击Use（使用）。

所选反应孔中显示探针任务与颜色。

F）单击Finish（完成）。

SDS软件即创建反应板文件。

分子生物操作手册

版本号：

B

修订号：

0

文件标题：

ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序

发布日期：

文件编号：

LAB-SOP-FZSW-011

生效日期：

编写人：

审核人：

发布部门：

中心主任：

批准人：

其他：

页码：

第2页，共4页

4.2.8输入样本名。

A）单击或选择View（视图）>WellInspector（反应孔设定）。

B）单击一个反应孔或拖动鼠标选取多个重复反应孔。

C）输入样本名。

D）如果必要，更改PassiveReference（阳性参比荧光）设置。

（默认情况下，选择ROX™荧光。

）

E）重复步骤b至d，直到您为反应板上的所有反应孔均指定好样本名与阳性参比荧光。

4.2.9在Setup（设定）选项卡上，检查并核对每个反应孔的信息。

4.3设置热循环条件并开始运行反应板

4.3.1选择Instrument（仪器）选项卡。

默认情况下，显示两步法反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法中PCR步骤的标准PCR条件。

4.3.2验证以下各项：

A）如果您使用两步法RT-PCR–则已设置默认的PCR热循环条件。

B）如果您使用“中山大学达安基因股份”的试剂–请按以下循环条件设置：

93℃2分钟→1个循环；93℃45秒→55℃60秒→40个循环。

C）SampleVolume（样本体积）为50µL。

D）9600Emulation选项选取。

4.3.3选择File（文件）>SaveAs（另存为），为绝对定量反应板文件输入一个文件名，然后单击Save（保存）。

4.3.4将反应板装入仪器中。

4.3.5单击Start（开始）。

在仪器运行PCR程序期间，Instrument（仪器）选项卡上会显示实时状态信息，并报告荧光信号强度。

程序运行结束后，状态值与按钮变为灰色，而且Analysis（分析）按钮（

）变为可用状态，并显示信息提示您程序是否成功运行。

程序运行期间生成的所有数据都保存到步骤4.3.3中指定的绝对定量反应板文件中。

4.4设置分析参数

4.4.1选择AmplificationPlot（扩增图谱）选项卡，然后从Data（数据）下拉列表中选择DeltaRnvsCycle（∆Rn随循环变化）。

4.4.2选择要在图谱上显示的反应孔。

（如果不作选择，图谱将显示为空白。

）

4.4.3从Detector（探针）下拉列表中，选择一个探针。

SDS软件显示所选探针与反应孔的图谱。

4.4.4为探针设置基线。

1）在AnalysisSettings（分析设置）下边，选择ManualBaseline（手动设置基线）。

2）在Start（cycle）（开始循环）与End（cycle）（结束循环）字段中输入相应的值，确保扩增曲线的增长从EndCycle（结束循环）值之后的循环处开始。

4.4.5为探针设置阈值。

1）在AnalysisSettings（分析设置）下边，选择ManualCt（手动Ct）。

2）用鼠标拖动阈值设置条，直到阈值位于：

•背景的上边

分子生物操作手册

版本号：

B

修订号：

0

文件标题：

ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序

发布日期：

文件编号：

LAB-SOP-FZSW-011

生效日期：

编写人：

审核人：

发布部门：

中心主任：

批准人：

其他：

页码：

第3页，共4页

•扩增曲线的平台期与线性增长期的下边

•扩增曲线的指数增长期之内

SDS软件调整阈值，并于分析之后在Threshold（阈值）字段中显示此值。

4.4.6重复步骤4.4.3至4.4.4，为实验分析中的所有剩余探针设置适当的基线与阈值。

4.4.7单击Analysis（分析）>Analyze（执行分析），以使用调整后的基线与阈值设置重新分析数据。

4.5分析并查看绝对定量数据

4.5.1Plate（反应板）选项卡：

显示每个反应孔的结果数据，包括：

•每个反应孔的样本名、探针任务与颜色。

•计算值-量值（默认值）、∆Rn或Ct。

选择Analysis（分析）>Display（显示）以选择要显示的值。

4.5.2Spectra（光谱）选项卡：

显示所选反应孔的荧光光谱。

•用鼠标指针点击并拖动Cycle（循环）滑块上的指示器，可查看每一循环的光谱。

•Cycle#（循环次数）文本框中显示滑块指示器的当前位置。

4.5.3Component（成分）选项卡：

显示整个PCR运行期间所选反应孔的每种荧光的完整光谱表现。

每次只能显示第一个选取的反应孔。

4.5.4AmplificationPlot（扩增图谱）选项卡：

在三个AmplificationPlot（扩增图谱）上，您可查看特定样本的扩增后荧光信号读取情况。

•AmplificationPlot（扩增图谱）上显示所选反应孔中的所有样本。

•Rnvs.Cycle（Linear）（Rn随循环变化，线性）视图：

显示校正后报告荧光强度（Rn）荧光随循环变化的曲线。

您可通过此图来识别与检查不规则扩增。

•∆Rnvs.Cycle（Log）（∆Rn随循环变化，对数）视图：

显示荧光（∆Rn）随循环数变化的曲线。

您可通过此图来识别与检查不规则扩增

•Ctvs.WellPosition（Ct值与反应孔位置关系）视图：

显示阈值循环（CT）与反应孔位置的关系变化图。

您可通过此图查找探针数据设置中不当设置的极端值。

4.5.5StandardCurve（标准曲线）：

显示指定为标准的样本标准曲线。

SDS软件根据此标准曲线推断并计算出未知样本的量。

4.5.6Report（报告）：

以表格方式显示所选反应孔的数据。

报告中的数据栏取决于正运行的实验分析类型。

对于绝对定量实验分析，可能包括以下数据栏：

Well（反应孔）、SampleName（样本名）、Detector（探针）、Task（任务）、Ct、StdDevCt（Ct值标准偏差）、Qty（数量）、MeanQty（平均数量）与StdDevQty（标准偏差数量）。

Qty（数量）栏中的值根据样本的标准曲线推断并计算得出。

在ReportSettings（报告设置）对话框中可设置报告显示格式与打印方式。

5.仪器维护保养

5.1每星期维护任务

•归档或备份SDS反应板文件

•使用不脱毛的布块擦拭仪器表面

5.2每月维护任务：

•执行背景校正

•执行计算机硬盘碎片整理程序

分子生物操作手册

版本号：

B

修订号：

0

文件标题：

ABI7500型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序

发布日期：

文件编号：

LAB-SOP-FZSW-011

生效日期：

编写人：

审核人：

发布部门：

中心主任：

批准人：

其他：

页码：

第4页，共4页

5.3半年维护任务：

•执行纯荧光校正

•执行目标区（ROI）校正

5.4其它维护任务：

需要时执行以下维护任务，以解决遇到的问题：

•去除样本块中的污染物

•更换卤素灯

•更换仪器保险丝

6.常见的故障与处理

6.1没有标准曲线：

•在设置样本信息时，在类型中没有设置为

•在设置样本信息中的

内没有填入数值

6.2没有扩增曲线：

•PCR设置参数错误，只收集了一个循环的信号

•硬盘休眠，没有收集循环的信号

6.3基线下滑：

修改基线范围为10-20，重新分析。

6.4扩增曲线断裂：

减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据。

6.5直线扩增曲线：

探针部分降解

7.校准：

ABI7500基因扩增检测仪校准工作需由专业工程师进行，每年校正一次，另外以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。

通过对室内质控图的分析，及时发现系统误差的出现。

经过分析排除了试剂与人员误差后，应进行仪器状态校验实验：

7.1使用标准化试剂作为校验试剂，分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。

7.3每年由专业人员进行上述实验，仪器若搬动或配套仪器（如UPS等）的变动亦需进行上述实验，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围与103标准品是否检出。

7.4当104标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。

如结果依然，联系厂家进行仪器校准。

7.5当仅有104标准品未检出时，检查实验全过程。

再次上机检测104标准品两枚。

如仍未检出，则联系厂家进行仪器校准。

7.6仪器经过校准后，重复该实验，结果归入仪器档案。