ITC200现场培训课程.pdf

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January20121GEHealthcareLifeSciencesMicroCalTMiTC200现场培训教程培训内容ITC的基本介绍ITC的基本实验流程DEMO实验数据分析维护保养等温滴定量热法（ITC）的介绍January20123微量热技术的种类两大主要技术两大主要技术MicroCaliTC200MicroCalAuto-iTC200MicroCalVP-CapillaryDSCMicroCalVP-ITCMicroCalVP-DSC差示扫描量热法（DSC:

Differentialscanningcalorimetry）等温滴定量热法（ITC:

Isothermaltitrationcalorimetry）工作原理参照校准加热器样品池主加热器样品校准加热器DP样品样品DP是为维持零温度差异所测得的参照池和样品池间的功率差异DT0DP=DifferentialpowerT=Temperaturedifference参照参照工作原理：

滴定前参照池5uW5uW样品池缓冲液样品工作原理：

滴定时5uW2uW3uW参照池样品池进行ITC实验“配体”放在进样针中“大分子”放于样品池测量反应热单次ITC实验所能得到的参数亲和力（KD）反应热（H）结合位点的数目（N）ReferencecellSamplecellSyringeITC实验的基本原理原始数据积分；将热量进行积分并运用合适的结合模型得到；亲和力（KD）,化学计量比（N）和反应焓变（DH）;通过热力学公式，计算得到反应熵变（DS）。

基于热量检测的通用技术-4-2000.51.01.52.00.00.51.01.52.0-4-20MolarRatiokcal/moleofinjectantDHNKDkcalmol-1ofinjectantMolarratiocals-1Time-KD:

AffinityN:

StoichiometryDH:

EnthalpyDS:

EntropyMicroCaliTC200用等温滴定量热法能二次筛选/hit验证中快速得到KD值测量靶点活性确认药物与靶点的结合用热力学指导先导化合物的优化研究作用机制确认IC50和EC50值测定酶动力学MicroCalAuto-iTC200MicroCalVP-ITCiTC200的实验基本流程January201219清洗机器实验参数设定开始实验样品准备iTC200的基本实验流程清洗机器保证滴定物与被滴定物间的缓冲液保持完全一致pH，盐浓度，DMSO浓度同一缓冲液中透析或者置换大分子和配体若配体太小无法透析，用蛋白透析液配置（eg.小分子或者多肽）准确测量浓度用A280准确测量蛋白浓度尽量准确地称取配体。

若配体带发光基团，使用UV测定浓度适用于广泛的缓冲体系几乎所有的缓冲液，如HEPES，PBS，glycine，acetate等均可使用如需使用还原剂，最好使用：

TCEP（Tris（2-carboxyethylphosphine）hydrochloride）-巯基乙醇（-mercaptoethanol，BME）21样品准备清洗样品池和进样针实验CellWash22SyringeWashCellandSyringewash用20%Contrad70TM（14%Decon90TM）清洗实验参数设定需要多少样品？

你是否知道大概的KD?

EstimatedKDMProteinMLigandMProtein/KD=C200.5-22020010-402-10505005-2510-1003040*KD0.3-31003020*KD0.3是是按照表格进行NoNo尝试20M蛋白和200M配体C=10-100最优C=5-500好C=1-5和500-1000能接受C=1000竞争ITC0.00.51.01.52.0-16-14-12-10-8-6-4-20MolarRatiokcal/moleofinjectantC=0.05C=0.5C=5C=50C=500C=Protein/KD实验参数设定C值如何使用C-value和KDSimulatedbindingisothermsforvariouscvalues.假设KD为1mMn=1选择C-value等于40样品池样品浓度=c-value*KD/n样品池样品浓度=40*0.000001/1样品池样品浓度=4x10-5M=40mM配体浓度滴定配体浓度=10-20样品池样品浓度体积：

典型2l（范围0.1-38l）-初始0.5l，随后18*2l持续时间：

4s间隔:

典型150s滤过时长:

5s,用于平均数据的数据采集时间跨度参考功率:

5to10cals/sec搅拌速度:

1000rpm反馈:

高实验参数设定典型实验参数应该在和滴定实验相同的实验条件下，将配体溶液滴定到缓冲液中千万不要忘记DMSO的影响，如果在缓冲液或者母液中被使用，DMSO浓度不匹配，会有很大的放热。

实验参数设定参考实验的设定DEMO实验January201229目标上手练习演示如何在MicroCalTMiTC200上设置和运行一个滴定实验5mMCalCl2滴定0.4mMEDTA（10mMMESbuffer,pH5.6），测定相互作用的KD，DH和DS31DEMO实验1.实验参数设置32DEMO实验1.实验参数设置33DEMO实验2.预计的结果原始数据积分后数据5mMCaCl2滴定MES缓冲液，相同设置January201234DEMO实验3.对照实验数据分析January201235目标演示如何检查数据演示如何扣减参照热演示如何用1:

1结合模型拟合数据了解从ITC数据中如何测定KD,N,H和S数据分析样品准备实验数据分析实验优化数据分析步骤1.导入数据2.检查数据3.调节浓度，基线，稀释热量4.模型拟合5.最终图片用Origin软件分析数据1.隐藏文本框2.读数据选择滴定和对照数据1.选择滴定和对照数据2.点击AddFile（s）3.点击OK查看原始数据点击Rawdata查看原始数据基线位置ok对照的热量很小且可重复层控制查看每次滴定的热量激活文件名后单击查看2nd滴定的热量第2滴的热量返回原始数据点击RawITC层控制从层中移除数据重设显示刻度范围重设刻度范围然后激活文件名然后点击确定平均参照热1

（2）选中NDH列-排除第1个数据点点击Statisticsoncolumns确定平均参照热2

（2）复制平均参照热数值查看校正后的结合热点击DeltaH结合热用层控制移除参照数据移除第1个数据点并扣除参照热1.移除第1个数据点2.使用SimpleMath扣减平均参照热53将前面复制的平均参照热数值粘贴在此处，点击OK在方框中填-号使用SimpleMath扣除参照热拟合数据1.拟合到onesetofsites模型2.反复多次以提高拟合3.查看Chi2，当此数值不再变化时，点击done，拟合结束拟合后数据N=0.86KD=1/KA=16nMH=-14.66kcals/mol仪器维护大纲维护概述常规的用户维护实验后如何处理MicroCalITC系统，处理后的状态?

如果没有进行常规维护会发生什么?

我什么时候可以呼叫维修工程师?

仪器维护为什么?

仔细和彻底的维护对MicroCalITC系统的性能是必要的样品池的清洁对数据质量有重要影响许多报告的“问题”源自不良的机器维护不良的机器维护可能影响重复性按照推荐的维护程序进行系统维护按照推荐的维护程序进行系统维护!

仪器维护如何做?

2个层次的日常维护常规的用户维护预防性维护操作（GEHealthcare维修工程师完成）需要的材料20%Contrad70或者14%Decon90EDTAtest试剂盒自带零件和工具仪器常规用户维护每次运行后每次滴定后用去垢剂清洁样品池20%Contrad70或14%Decon90去离子水溶液MicroCalAuto-iTC200系统用PlatesPlates自动方法或使用DetergentCleanDetergentCleanscriptscript的其他的其他方法方法MicroCaliTC200系统使用CellandSyringeWashCellandSyringeWash命令仪器常规用户维护每周维护用去垢剂进行彻底的样品池清洗20%Contrad70或14%Decon90去离子水溶液MicroCalAuto-iTC200系统用去垢剂在60C浸泡1小时选择SystemSystem标签里的CleanCleanCellCell按钮或用PlatesCleanPlatesClean自动方法运行1个实验MicroCaliTC200系统用去垢剂在60C浸泡30分钟执行DetergentSoakandRinseDetergentSoakandRinse（long）（long）命令用蒸馏水重新充满参比池每300循环更换活塞头仪器常规用户维护每月维护仔细检测加样针的玻璃是否破裂如有任何损坏迹象立即更换进样针更换活塞头每月或每300个循环更换每月清洗进样针（或者反相滴定（蛋白放于折射器中）后）作为预防性维护：

MicroCalAuto-iTC200系统自动化模式下用PipetteCleanwithDetergentPipetteCleanwithDetergentscript设立方法e.g.PlatesSyringePlatesSyringeCleanCleanMicroCaliTC200系统将2x100l的20%Contrad70（or14%Decon90）吸入到注射器，然后用AccessoryAccessoryStationStation上的SyringeSyringerinserinselonglong方法用清水冲洗MicroCaliTC200系统的诊断步骤1.使用清洗模块执行CellCellWaterWaterRinseRinse（Long（Long）2.用水充满样品池和参比池3.彻底清洁滴定针4.用水充满进样针5.点击RealRealTimeTimePlotPlot标签中的ExtendedExtendedDataDataModeMode激活激活扩展数据模式，以包括所有MicroCaliTC200系统产生的数据6.执行至少15次2l的水滴水滴定7.将水滴定文件发送给当地的应用专家MicroCalAuto-iTC200系统的诊断步骤1.充满参比池2.更换活塞头3.点击RealRealTimeTimePlotPlot标签中的ExtendedExtendedDataDataModeMode激活激活扩展数据模式，以包括所有MicroCalAuto-iTC200系统产生的数据4.执行2次水滴水实验，每次包括至少15次的2l的滴定。

第1次用platesplatescleanclean自动化方法，第2次用platesplatessyringesyringecleanclean5.将第2个水滴定文件发送给当地的应用专家长期不用如何处理MicroCalITC系统?

如果系统长期不用，应该先彻底清洁并将池子中液体抽出，保持池子干燥。

不用时关闭机器MicroCalAuto-iTC200系统运行PlatesCleanPlatesCleanscript（每周维护），长期关闭前运行platesplatessyringecleansyringecleanscriptMicroCaliTC200系统用20%Contrad（或14%Decon）充满样品池，加热到600C后维持1小时，然后使用清洗模块执行CellCellWaterRinse（LongWaterRinse（Long）将2x100l的20%Contrad70（or14%Decon90）吸入到进样针，然后用AccessoryStationAccessoryStation上的SyringeSyringerinselongrinselong方法用清水冲洗我该何时呼叫维修工程?

随时电话!

WEREHERETOHELPYOU!

请电话联系您当地的维修工程师请电话联系您当地的维修工程师固话请拨800-810-9118（免费）手机请拨400-810-9118（收取市话费）本章小结为何需要做维护?

避免问题，保证数据质量哪个维护程序需要在每次运行后执行?

用去垢剂清洁样品池哪个维护程序需要每周执行?

用去垢剂彻底清洁样品池，充满参比池并替换进样针的活塞头哪个维护程序需要每月执行?

更换和清洁滴定针何时该呼叫维修工程师?

任何时候!