果蔬中维生素C的测定实验Word下载.docx

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图1　维生素C的构造式及其氧化还原

异抗坏血酸是抗坏血酸的异构体,化学性质与抗坏血酸相似,易被吸收，但几乎没有抗坏血酸的生理活性（仅约二十分之一）。

异抗坏血酸和抗坏血酸棕榈酸酯只用作抗氧化剂，防止食品变质、水果变色以及腌肉。

VC是无色晶体，属于水溶性维生素，易溶于水，水溶液呈酸性。

在酸性溶液中稳定，在中性或碱性溶液中易被氧化分解，遇热极易破坏。

具有较强的还原性，易氧化，铁、铜等金属离子能够加速其氧化速率。

一、实验目的

通过本实验加深对2，6—二氯靛酚滴定法测定果蔬中维生素C的原理的理解，掌握其操作要点，熟练基本操作技术。

二、实验原理

2、6—二氯靛酚是一种染料，其颜色反应表现为两种特性。

一是取决于氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态为无色；

二是受其介质酸度的影响，在碱性介质中呈深蓝色，在酸性溶液介质中呈浅红色。

用蓝色的碱性染料标准液，滴定含VC的酸性浸出液，染料被还原为无色，到达终点时，微过量的2、6—二氯靛酚染料在酸性溶液中呈浅红色即为终点。

从染料消耗量即可计算出试样中还原型抗坏血酸量。

AA+氧化型染料（碱性）→DAA+还原型染料

（蓝色）（浅红色）

还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身则氧化为脱氢型。

在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。

因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。

一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。

所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。

如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。

本法用于测定还原型抗坏血酸，测定总抗坏血酸含量常用2,4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定。

三、材料

猕猴桃、黄瓜、卷心菜各500g。

四、仪器：

1、研钵（1个/2组）【代替高速组织捣碎机:

8000r/min～12000r/min】

2、扭力天平（感量0.01g）3、小刀（4把/班，合用）

4、50mL移液管（2支/全班）5、500mL、50mL烧杯（2个//2组）

6、胶头吸管（1支/组）7、100mL容量瓶（1个/组）

8、细玻璃棒（1支/组）9、漏斗（1个/组）

10、滤纸（2张/组）

11、10mL、5mL、2mL、1mL移液管（1支/2组）

12、100mL、50mL锥形瓶（3个/组）

13、碱式滴定管（1支/组）14、电炉（2个/2组）

结合实验想一想，以上列举仪器全面吗？

五、试剂

1、20g/L草酸溶液：

称取20g草酸，加水至1000mL；

2、10g/L草酸溶液：

称取10g草酸，加水至1000mL；

3、淀粉指示剂：

取1g可溶性淀粉，加10mL冷水调成稀粉浆，倒入正在沸腾的100mL水中，搅拌至透明，放冷备用。

4、60g/L碘化钾溶液。

5、0.0167mol/LKIO3标准溶液：

准确称取经105℃烘干2h的基准碘酸钾3.5670g（0.3567g），用水溶解并稀释至1000mL（100mL）。

【KIO3分子量214】

6、1.67×

10-4mol/LKIO3标准溶液。

准确吸取0.0167mol/LKIO3标准溶液1mL，用水稀释至100mL。

此溶液1mL相当于维生素C0.088mg。

7、异戊醇。

结合实验想一想：

（1）以上列举试剂全面吗？

（2）以上两种草酸溶液各有什么用途？

六、操作方法：

（一）维生素C标准使用液的配制与标定。

1、配制维生素C标准贮备液：

精密称取20mg纯L-抗坏血酸，用10g/L草酸溶解，并定容至100mL。

注：

相近两组做一份共用

2、配制维生素C标准使用液：

吸取维生素C标准贮备液5mL于50mL容量瓶中，用草酸溶液（10g/L）定容。

3、标定：

准确吸取上述维生素C标准使用液25.0mL于50mL锥形瓶中，加入0.5mL60g/L碘化钾溶液，3～5滴淀粉指示剂（10g/L），混匀后用0.0010mol/L标准碘酸钾溶液滴定至淡蓝色（极淡蓝色）为终点。

重复操作三次，取平均值计算L-抗坏血酸的浓度。

式中：

C—维生素C的浓度，mg/mL；

V1—滴定时消耗1.67×

10-4mol/L碘酸钾标准溶液的体积，mL；

V2—吸取维生素C标准使用液的体积，mL；

【5mL】

0.088—1.00mL碘酸钾标准溶液（1.67×

10-4mol/L）相当的维生素C的量，mg。

提示：

1、标定原理

还原型VC+I2→脱氢型抗坏血酸+2HI

KIO3+3H2C2O4+5KI→3I2+3K2C2O4+3H2O

2、滴定时可同时吸取两份。

一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考。

（二）2、6—二氯靛酚的配制与标定：

配制：

称取52mg碳酸氢钠，溶解于200mL热蒸馏水中，然后称取50mg2，6—二氯靛酚溶解于上述碳酸氢钠溶液中，冷却后，移入250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容。

过滤于棕色瓶内，保存于冰箱中。

每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度。

标定：

吸取已知浓度的维生素C标准使用溶液5.00mL于50mL锥形瓶中，加5mL10g/L草酸溶液，用2.6—二氯靛酚溶液滴定至呈粉红色，且15s不褪色即为终点。

同时，另取5mL10g/L草酸溶液做空白试验。

重复操作三次，取平均值计算L-抗坏血酸的浓度。

T—每mL2，6—二氯靛酚溶液相当于维生素C的毫克数；

C—维生素C标准使用液的浓度，mg/mL；

V—标定时吸取维生素C标准使用液的体积，mL；

V1—滴定抗坏血酸溶液消耗2，6—二氯靛酚的溶液的体积，mL。

V2—滴定空白所用2，6－二氯靛酚溶液的体积,mL。

（三）样品处理

1、去除不可食性部分：

苹果去皮、核；

黄瓜、：

清洗；

2、粉碎：

称取新鲜的具有代表性样品的可食部分100.00g，迅速置打碎机中，用移液管准确加入20g/L草酸溶液100mL，快速打成匀浆，转移至500mL洁净的烧杯中备用。

3、浸提：

用50mL干净、干燥的小烧杯在扭力天平上称取匀浆20.00g，加入适量的（10mL~20mL）10g/L草酸，搅匀，小心转移至100mL容量瓶中，用10g/L草酸稀释定容，摇匀。

4、过滤：

用小漏斗和滤纸过滤，取中间滤液备用，用50mL小烧杯承接。

想一想：

1、加入20g/L草酸溶液的目的是什么？

2、新鲜的具有代表性样品的可食部分100.00g应采用什么仪器称量？

3、为什么要取中间滤液？

4、过滤的规范操作应注意哪些方面？

1、若滤液有色,可按每克样品加0.4g白陶土脱色后再过滤。

2、维生素C在酸性条件下较稳定，故样品处理或浸提都应在弱酸性环境中进行。

浸提剂以偏磷酸（HPO3）稳定维生素C效果最好，但价格较贵。

一般可采用草酸（20g/L）代替偏磷酸，价廉且效果也较好。

3、测定维生素C时，应尽可能分析新鲜样品，在不发生水分及其它成分损失的前提下，样品尽量捣碎，研磨成浆状。

需特别注意的是：

研磨时，加与样品等量的酸提取剂以稳定维生素C。

（四）滴定

吸取样品处理液滤液10.00mL于50mL锥形瓶中，迅速用已标定过的2、6—二氯靛酚溶液滴定，至溶液出现红色，15S不褪色为终点。

重复三次，平行误差＜0.1mL。

同时作空白试验：

吸取10.00mL1%草酸溶液于50mL锥形瓶中，迅速用已标定过的2、6—二氯靛酚溶液滴定，至溶液出现红色，15S秒不褪色为终点。

整个操作过程应迅速，滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色15秒内不消失为止。

样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较慢，故滴定终点以出现红色15秒不褪色为终点。

1、如何准确判断滴定终点？

2、样品处理液滤液10.00mL相当于多少原始样品？

3、本法终点指示剂是什么？

其变化特点是什么？

4、10mL样品处理液滤液、10mL1%草酸溶液如何取？

七、数据记录与计算

（一）数据记录

1、维生素C标准使用液的标定

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

平均值

滴定时消耗碘酸钾标准溶液的体积，mL

吸取维生素C标准使用液的体积，mL

维生素C的浓度，mg/mL

=

2、2、6—二氯靛酚的配制与标定

滴定标准抗坏血酸使用溶液消耗2,6—二氯靛酚的溶液的体积，mL

滴定空白所用2,6－二氯靛酚溶液的体积,mL

标定时吸取维生素C标准使用液的体积，mL

维生素C标准使用液的浓度，mg/mL

每mL2,6—二氯靛酚溶液相当于维生素C的毫克数

（3）样品中还原性抗坏血酸含量的测定

滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL

滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL

称取匀浆相当于原样品的质量，g

1mL染料溶液（2,6—二氯靛酚溶液）相当于维生素C的质量，mg；

样品中还原型维生素C的含量，mg/100g

（二）结果计算

X—样品中还原型维生素C的含量，mg/100g；

T—1mL染料溶液（2,6—二氯靛酚溶液）相当于维生素C的质量，mg；

V—滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL；

V0—滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL；

m—称取匀浆相当于原样品的质量，g。

公式中各种数字和符号的意义！

要求：

平行测定的结果，用算术平均值表示，取三位有效数字，含量低的保留小数点后两位数字。

平行测定结果的相对相差，在维生素C含量大于20mg/100g时，不得超过2％，小于20mg/100g时，不得超过5％。

八、课时总结

1、本法测定的结果为食品中的还原型L-抗坏血酸含量，而非维生素C总量。

此法是测定还原型L-抗坏血酸最简便的方法，适合于大批果蔬，但对红色果蔬不太适宜。

。

3、样品处理过程中加入等量的2%草酸，目的是抑制抗坏血酸氧化酶，避免维生素C氧化损失，也可用2%偏磷酸代替。

4、某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物在100mL容量瓶中泡沫太多，可加入戊醇2~3滴消除之。

5、同法作空白实验，消除系统误差。

6、整个操作过程应迅速，滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色15秒内不消失为止。

7、操作要迅速，防止还原型维生素C被空气中的氧化。

滴定过程一般不超过2min。

滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。

8、整个操作过程应迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化。

滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色15s内不消失为止。

样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较慢，故滴定终点以出现红色15s不褪色为终点。

滴定时，可同时吸二个样品。

9、所有试剂配制最好用重蒸馏水。

整个操作过程尽量避免溶液接触金属离子。

10、对动物性的样品可用10%三氯醋酸代替2%草酸溶液提取；

对含有大量Fe的样品，如储藏过久的罐头食品可用8%醋酸溶液代替草酸溶液提取。

11、若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土吸附色素后再过滤。

白陶土使用前应测定回收率，同时做空白试验。

12、2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。

13、干扰滴定因素有：

（1）色素若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1mL氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。

（2）Fe2＋Fe2＋可还原二氯酚靛酚。

对含有大量Fe2＋的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2＋不会很快与染料起作用。

（3）样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。

（4）若试样中含有Fe2＋、Cu2＋、Sn2＋、亚硫酸盐等还原性杂质，会使结果偏高。

可通过以下方法来校正：

取10mL提取液两份，各加入10g/L硫酸铜溶液1mL，在110℃加热10min，冷却后用染料滴定。

有铜存在时，抗坏血酸完全被破坏，从样品滴定值中扣除校正值，即得抗坏血酸含量。

14、提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。

九、实验结果与分析讨论

（一）检测结果及质量评价

1、说明检测结果

2、查阅“食物成分表”，核对被测水果或蔬菜的维生素C含量（mg/100g）。

（二）分析讨论

1、如果计算结果与“食物成分表”中的相应数值有误差，请分析出现误差的可能原因。

2、为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？

为什么？

十、思考题：

1、试述本法测定维生素C的原理。

2、试述碱性染料的变色特征？

3、在生产和储备食品过程中，L-抗坏血酸能被氧化成L-脱氢抗坏血酸。

你如何用2，6-二氯酚靛酚滴定法来测定总的维生素C含量，以及如何分别测定这两种形式。

4、食品中维生素C测定的方法有哪些，各自的原理和适用范围是什么？

5、测定脂溶性维生素时样品需如何处理？

6、测定水溶性维生素时、从样品中提取浓缩可采用那些方法？

7、计算题：

2、6-二氯靛酚法测定维生素C含量。

已知维生素C标准使用液的浓度是0.02mg/mL。

（1）标定2、6-二氯靛酚：

取维生素C标准使用液5.00mL，于小锥形瓶中，加5mL10g/L草酸溶液，用欲标定的2、6-二氯靛酚溶液滴定。

三次消耗的体积为：

1.01mL；

1.00mL；

0.99mL。

（2）称取去除不可食部分的菠萝100.00g，加等量20g/L草酸溶液，打成匀浆。

称取匀浆20.00g于小烧杯中，用10g/L草酸溶液稀释至100mL，过滤，取中间滤液备用。

（3）吸取样品处理滤液10mL，于50mL锥形瓶中，迅速用上述标定过的2、6-二氯靛酚溶液滴定。

三次消耗2、6-二氯靛酚溶液的体积为：

3.20mL；

3.19mL；

3.21mL；

空白试验三次消耗2、6-二氯靛酚溶液的体积为：

0.10mL；

0.09mL；

0.11mL；

问题1：

试根据题意,完成原始数据记录表

问题2：

试计算试样中维生素C含量。

项目

标定2、6-二氯靛酚溶液消耗的体积，mL

维生素C标准使用液的浓度，mg/mL

1mL2,6—二氯靛酚溶液相当于维生素C的质量，mg；

河南农业职业学院课时授课方案

（两个学时为一个授课单元）

授课日期

2007年1月10日1～4节

2007年1月11日1～4节

授课班次

食品生物技术05-1班

食品生物技术05-2班

课时教学课题（章节）：

实验十一：

火腿肠中亚硝酸钠含量的测定—盐酸萘乙二胺比色法

课时教学目的：

1、掌握盐酸萘乙二胺比色法火腿肠中亚硝酸钠含量的原理、基本过程和操作关键。

2、熟练吸光光度分析法的原理、定量方法和721分光光度计的操作方法。

3、掌数据处理和结果计算技术。

1、盐酸萘乙二胺比色法火腿肠中亚硝酸钠含量的原理。

2、比色法火腿肠中亚硝酸钠含量的基本过程和操作关键。

引入新课：

1．亚硝酸钠

亚硝酸钠为白色或微黄色结晶或颗粒状粉末，无臭，味微咸，易吸潮，易溶于水，微溶于乙醇，在空气中可吸收氧而逐渐变为硝酸钠。

本品是食品添加剂中急性毒性较强的物质之一，是一种剧药（在药物学中，根据毒性试验结果，把毒性较强的物质称为剧药，如亚硝酸钠、氢氧化钠等；

把毒性更强的称为毒药，如三氯化二砷等）。

过量的亚硝酸盐进入血液后，可使正常的血红蛋白（二价铁）变成高铁血红蛋白（三价铁），失去携氧的功能，导致组织缺氧。

潜伏期仅为0.5～1小时，症状为头晕、恶心、呕吐、全身无力、皮肤发紫，严重者会因呼吸衰竭而死。

ADI（每日允许摄入量）为0～0.2mg/kg。

我国规定：

本品可用于肉类罐头和肉制品，最大使用量为0.15mg/kg。

残留量以亚硝酸钠计，肉类罐头不得超过0.05mg/kg，肉制品不得超过0.03mg/kg。

此外，还规定亚硝酸盐可用于盐水火腿，但应控制其残留量为70ppm。

2．硝酸钠

硝酸钠的毒性作用主要是因为它在食物中、水或胃肠道，尤其是在婴幼儿的胃肠道中，易被还原为亚硝酸盐所致，其ADI为0～5mg/kg。

本品可用于肉制品，最大使用量为0.5g/kg，其残留量控制同亚硝酸钠。

3．亚硝酸盐的安全性问题

近年来，人们发现亚硝酸盐能与多种氨基化合物（主要来自蛋白质分解产物）反应，产生致癌的N－亚硝基化合物，如亚硝胺等。

亚硝胺是目前国际上公认的一种强致癌物，动物试验结果表明：

不仅长期小剂量作用有致癌作用，而且一次摄入足够的量，也有致癌作用。

因此，国际上对食品中添加硝酸盐和亚硝酸盐的问题十分重视，在没有理想的替代品之前，把用量限制在最低水平。

4．关于亚硝酸盐替代品问题

许多世纪以来，人们一直使用亚硝酸盐来保存肉类。

到19世纪末，才认识到亚硝酸盐可使腌肉产生颜色。

后来，人们发现亚硝酸盐可抑制引起肉类变质的微生物生长，特别是对肉毒梭菌有很强的抑制作用。

有些国家在没有使用亚硝酸盐之前，肉毒梭菌中毒率很高，使用后，肉毒梭菌中毒才得到了控制。

亚硝酸盐除抗菌作用外，还有抗氧化及增强风味的作用。

尽管如此，由于亚硝酸盐的安全性即致癌问题，使其应用越来越受到限制，全世界都在寻找理想的替代品。

目前人们使用的亚硝酸盐替代品有两类：

一类是替代亚硝酸盐的添加剂，Sweet（1991）报道，这种替代物由发色剂、抗氧化剂/多价螯合剂和抑菌剂组成，发色剂用的是赤鲜红，抗氧化剂/多价螯合剂为磷酸盐/多聚磷酸盐，抑菌剂用的是对羟基苯甲酸和山梨酸及其盐类；

另一类是在常规亚硝酸盐浓度下阻断亚硝胺形成的添加剂，Mirrish等报道，抗坏血酸能与亚硝酸盐作用以减少亚硝胺的形成。

此外，山梨酸、山梨酸醇、鞣酸、没食子酸等也可抑制亚硝胺的形成。

一、原理

样品以处理，沉淀蛋白质，去除脂肪后，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸在弱酸性条件下发生重氮化反应，再与盐酸萘乙二胺偶合，形成紫红色的染料，在538nm处有最大吸收，其颜色的深浅与亚硝酸盐含量成正比。

二、仪器

名称

数量

1、分析天平

1架/2组

2、粉碎机（组织捣碎机）

1台/班

3、50mL烧杯

1个/组

4、500mL烧杯

5、电炉

1个/2组

6、水浴锅

1台/4组

7、10mL移液管

2支/组

8、500mL容量瓶

9、玻璃棒

10、5mL移液管

11、漏斗

12、带有铁圈的铁加台

13滤纸

2张/组

14、20mL移液管

1支/组

15、50mL容量瓶

16、1mL、2mL移液管

另：

作标准曲线组：

1、50mL容量瓶（9个/组）

2、1mL、2mL、5mL吸量管（各1支/组）

3、2mL、1mL移液管（1支/组）

三、试剂

1、亚铁氰化钾溶液：

称取11g亚铁氰化钾溶于100mL水中。

2、乙酸锌溶液：

称取22g乙酸锌溶于少量水中，加冰醋酸3mL，稀释到100mL。

3、饱和硼酸溶液：

称取50g硼砂（Na2B4O7·

10H2O）溶于500mL水中，冷却后使用。

4、4%的对氨基苯磺酸溶液：

称取对氨基苯磺酸0.4g，溶于100mL20%的盐酸溶液中，避光保存。

5、0.2%盐酸萘乙二胺溶液：

称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中，避光保存。

6、亚硝酸钠标准贮备液[ρ（NaNO2）=0.2mg/mL]：

精密称取在干燥器中干燥24h的分析纯亚硝酸钠0.1000g，用水溶解后移入500mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

7、亚硝酸钠标准使用液[ρ（NaNO2）=0.2mg/mL]：

临用时准确吸取标准贮备液5mL于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

四、操作方法

（一）样品处理

1、粉碎：

将牛肉、火腿肠置粉碎机内打碎均匀。

2、称量：

用分析天平称取样品5.0g于50mL烧杯中。

3、加热蒸馏水、开启水浴锅：