基因工程重点总结Word格式.docx
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7、影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度
蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等
解决方法：
加大酶的用量，1mgDNA用10U酶
加大反应总体积，延长反应时间。
②DNA甲基化程度
③反应条件
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Staractivity现象。
EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5‘PuPuATPyPy3’
④酶的纯度
⑤酶切反应的温度和时间
大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如SmaI为25度。
酶解时间可以通过加大酶量而缩短。
8、限制性内切酶的命名
二、DNA连接酶
1.两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶
需要NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体DNA连接酶
以ATP作为辅助因子；
不但能连接粘性末端；
还能连接齐平末端；
RNA:
DNA杂交分子中RNA上的缺口。
2.T4噬菌体RNA连接酶
催化单链DNA或RNA的
5‘-p与3’-OH共价链接
（1）连接条件
1 必须是两条双链DNA。
2 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。
3 需要能量
动物或噬菌体中：
ATP；
大肠杆菌中：
NAD+
4 只能连接相邻核苷酸之间的缺口
3.影响连接反应的因素
（1）DNA末端的浓度
（2）反应温度
（3）ATP浓度
三、常用的DNA聚合酶的特点
1.共同特点
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
2.主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同
3.DNA聚合酶在基因工程中的用途
（1）大肠杆菌DNA聚合酶I
基本性质：
5’→3’的DNA聚合酶活性;
5’→3’的核酸外切酶活性；
3’→5’的核酸外切酶活性。
基本用途
缺口前移标记法：
Nicktranslation（切口平移）；
制备³
²
P标记的探针。
（2）Klenowfragment
①Klenowfragment的性质
具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。
（失去了5’→3’外切酶活性）。
②基本用途
v3’端补平
补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。
vDNA3’末端标记
在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。
v在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成。
v双脱氧末端终止法测定DNA序列
（3）T4DNA聚合酶
①基本特性：
a.具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。
b.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切
c.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止
d.在有四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
a.补平隐蔽末端；
b.DNA3’末端标记
③标记
a.放射性标记
b.非放射性标记
i）生物素标记：
Ø
生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R
可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。
也可以被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。
生物素的识别——亲和素：
能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：
抗生物素蛋白（avidin）：
是一种鸡卵清蛋白
链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：
细菌中avidin的类似物
ii）地高辛标记：
可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。
形成地高辛标记的DNA探针。
地高辛的结合物是抗地高辛抗体。
iii）偶联酶及其底物
常用的两种酶：
辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）
酶的作用：
催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。
iv）用非放射性标记的探针检测原理
探针DNA用生物素或地高辛标记，亲和素或地高辛抗体与酶偶联，酶催化一个发光或显色反应，亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。
核酸探针杂交筛选法的缺点是：
只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。
（4）T7DNA聚合酶
①从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：
✓T7基因5编码的大亚基：
有5’→3’的DNA聚合酶和3’→5’的核酸外切酶活性
✓大肠杆菌编码的小亚基：
硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性
②T7DNA聚合酶的特点：
◆持续合成能力强：
一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
◆3’→5’外切酶活性高：
单链和双链都能降解。
◆不受DNA二级结构的影响
③T7DNA聚合酶的用途
✧以大分子量DNA为模板的合成：
如M13
✧进行末端标记：
与T4DNA聚合酶相同
✧补平隐蔽末端：
合成补平3’隐蔽末端；
水
解修平3’突出末端。
（5）修饰后的T7DNA聚合酶
①T7DNA聚合酶的化学修饰
去除3’→5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。
②修饰后的T7DNA聚合酶的用途
●Sanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测
序的理想用酶
●标记DNA3’隐蔽末端
●③更有效地补平末端
（6）Taq-DNA聚合酶
具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；
催化5’→3’的DNA新链合成，最适温度68～72℃，合成速度1200bases/min；
在合成的DNA链的3’端常多一个“A”；
不具3’→5’的外切酶活性,即无校正功能，大约每合成500个碱基要错配一个；
具微弱的5’→3’的DNA外切酶活性。
（7）pfu聚合酶
v具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；
v催化5’→3’的DNA新链合成，最适温度68～72℃，合成速度600bases/min；
v合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A；
v合成的DNA片段长度在2kb以内；
v具3’→5’的外切酶活性,即有校正功能；
v无5’→3’的DNA外切酶活性。
（8）TaqPlusIDNAPolymerase
✓具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；
✓催化5’→3’DNA新链合成，68～72℃最适；
✓可合成10-30kb的长DNA片段；
✓合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A；
✓具3’→5’的外切酶活性,有很强的校正功能，
大约每合成1.6x106个碱基要错配一个；
✓具微弱的5’→3’的DNA外切酶活性。
（9）PyrobestDNApolymerase
◆高保真性（HighFidelity）和Pfu等DNA聚合酶相同，Taq的10倍以上。
◆良好的扩增性能，优于Pfu等DNA聚合酶。
◆扩增得到的PCR产物为平滑末端
（10）依赖于RNA的DNA聚合酶
反转录酶的基本特性：
以RNA为模板聚合cDNA链
1 M-MuLV:
鼠源RT,来源于鼠白血病病毒（MoloneyMurineLeukemiaVirus）
最适温度42℃,以RNA、DNA或RNA∶DNA杂分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅助因子，具有RNaseH活性，特异性地对RNA∶DNA杂分子中的RNA降解
2 禽源RT,来源于鸡成髓细胞增多症病毒（AvianMyeloblastosisvirus）（特点同上）
3 PowerscriptReverseTranscriptase
CLONETECH公司的专利产品，源于M-MuLV的一个点突变。
无RNaseH活性，故合成的cDNA不会因此变短。
具有末端转移酶活性，倾向加3个“C”。
用于合成全长cDNA。
3、核酸酶
1.单链核酸外切酶：
核酸外切酶VII（ExoVII）
大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+
2.双链核酸外切酶：
核酸外切酶III（ExoIII）
大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切
3.双链核酸外切酶：
λ核酸外切酶（λExo）
λ核酸外切酶特异性地从5‘端外切
4.单链核酸内切酶：
S1核酸酶
S1核酸酶基本特性：
降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍；
Zn2+必需；
最适pH范围为4.0-4.3；
需要NaCl10-300mM；
降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。
5.Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的基本特性：
A:
来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）
B:
单链内切双链外切的核酸酶：
Bal31核酸酶的基本用途：
诱发DNA突变
四、核酸修饰酶
1.末端脱氧核苷酸转移酶
5’→3’DNA聚合酶活性
①末端转移酶的特性：
✓需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。
✓不需要模板。
✓底物可以是单链DNA是3’—OH突出的双链DNA平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。
✓随机添加的dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。
②末端转移酶的用途：
✧同聚物加尾：
给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。
✧再生酶切位点：
便于回收克隆片断。
✧非放射性标记DNA片断的3’端：
催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。
（生物素-11-dUTP等）
2.T4多核苷酸激酶P35
①功能：
催化γ磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。
（不论5’-OH端突出与否）
如果ATP的γ磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。
但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。
②多核苷酸激酶的用途：
◆正向反应（forwardreaction）
◆交换反应标记法
反应混合物中具有超量（γ-32P）ATP和ADP时，
多核苷酸激酶能催化（γ-32P）ATP的-32P与
DNA5’端的磷酸交换。
3.碱性磷酸酶（参见P35）
来源于牛小肠碱性磷酸酶
可催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5’磷酸变为5’-OH末端
第三章用于基因克隆的载体
载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞；
为外源基因提供复制能力或整合能力；
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
载体应具备的条件：
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性），具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，具有较高的外源DNA的载装能力，具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的筛选标记。
一、质粒载体（P42-43）
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中；
C:
绝大多数的质粒是DNA型的；
D:
绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；
E:
质粒DNA的分子量范围：
1-300kb。
1.天然质粒的缺陷
（1）分子量大，拷贝数低；
（2）筛选标记不理想。
2.理想载体条件
（1）具有较小的分子质量和较高的拷贝数
（2）具有若干限制性内切酶的单一酶切位点，以满足基因克隆的需要
（3）具有两个以上的选择标记基因
（4）缺失的mob基因
（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达
3.质粒的选择标记及其工作原理
绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：
氨苄青霉素抗性（Ampr）
卡那霉素抗性（Kanr）
四环素抗性（Tetr）
链霉素抗性（Strr）
氯霉素抗性（Cmlr）
i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。
a.抑菌原理，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。
b细菌抗性原理：
Ampr基因编码β-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的β-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a.抑菌原理：
通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
杀死生长的细菌。
b.细菌抗性原理：
Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。
iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）
a.杀菌原理：
通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。
杀死细菌。
Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。
iv）链霉素（Streptomycin，Str）
通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。
Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。
v）四环素（Tetracycline，Tet）
通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
4.重要的大肠杆菌质粒载体
（1）pBR322:
松弛型复制；
氯霉素可扩增；
拷贝数50-100/cell；
用于基因克隆。
a.元件来源：
①复制起点ori：
pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点；
②Ampr基因：
pSP2124质粒的Ampr基因；
③Tetr基因：
pSC101的Tetr基因。
b.选择标记:
氨苄青霉素和四环素抗性
c.pBR322的优点:
①双抗菌素抗性选择标记：
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡。
②分子小，克隆能力大：
载体越小越好。
>
10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③高拷贝数：
氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy
④安全：
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。
不能通过接合转移。
（2）pUC18/19（P43）：
拷贝数2000-3000/cell；
装有多克隆位点（MCS）；
正选择颜色标记lacZ’；
用于基因克隆和测序。
a.元件来源:
①复制起点:
pBR322的ori
②Ampr基因:
pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。
③lacZ的启动子:
大肠杆菌
④lacZ’基因:
大肠杆菌lacZ的α-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。
b.正选择标记lacZ’的显色原理:
β-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
①α-肽（lacZ’）：
β-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.;
②受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）
受体菌基因组的β-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失α肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal
③载体lacZ’与α互补
pUC质粒载体上的lacZ’编码α肽与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。
又能分解Xgal。
产生蓝色物质。
④α互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点（MCS）区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。
不能互补。
c.IPTG的诱导作用
IPTG是乳糖的类似物。
能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。
从而互补。
d.pUC系列载体的优点
①更小的分子量
②选择方便:
Xgal显色、抗菌素双重直接选择。
③克隆便利:
具有多克隆位点（MCS）
④测序方便
（3）pGEM-3Z
由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。
可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录
pGEM-3Z的特点：
①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA
②外源基因正接反接都可以转录。
③MCS与pUC18的完全一样。
（5）噬菌体或病毒DNA（P52-56）
①噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
a.高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
b.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
（6）单链噬菌体载体
①M13的生活周期
M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA，+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA，－DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白，组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞。
②M13载体的构建
a.克隆区域的选定
i.基因间隔区（intergenicregion,IG区）
M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。
ii.酶切位点
IG区内只有一个BsuI切点。
b.加入酶切位点
i.在IG区内加入单一内切酶位点
（7）黏粒质粒（P71-76）:
组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性标记（ampr）、cos位点
（8）噬菌粒（phagemidorphasmid）
噬菌粒载体的特点
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体
a.能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞；
b.能像质粒那样在受体细胞中自主复制；
c.装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）；
d.通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA；
e.重组操作简便，筛选容易
（9）人工染色体
酵母人工染色体载体（YAC）
细菌人工染色体载体（BAC）
（10）表达载体构建的原则
1阅读框与外源基因高效表达
2启动子与外源基因高效表达
3转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达
4有效地翻译起始与外源基因高效表达
5终止密码选择与外源基因高效表达
6外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
第四章核酸操作的基本技术
1核酸提取基本原理
（1）碱抽提法提取质粒DNA原理
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；
染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
（2）所用的试剂作用
①溶菌酶
能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键。
在碱性条件（pH>
8）下有活性。
②葡萄糖
增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。
③EDTA
Mg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。
④NaOH-SDS
NaOH：
强碱，提供pH>
12的碱性条件，使DNA双链变性。
SDS:
溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质变性沉淀。
⑤NaAc-HAc缓冲液
冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。
用来中和NaOH变性液，使DNA复性。
高浓度的NaAc有利于变性的大分子沉淀。
⑥乙醇
用于沉淀DNA。
DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。
⑦RNaseA
降解RNA渣滓。
以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
⑧TE缓冲液
DNA保存液。
由Tris-HCl和EDTA配制。
Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；
EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。
（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤
第一步：
溶菌
使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。
SolutionI的配制：
50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA
第二步：
破膜，蛋白质和DNA变性
溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。
SolutionII的配制：
0.2NNaOH，1.0%SDS
第三步：
中和
溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。
SolutionIII的配制：
3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）
第四步：
离心除去沉淀
上清液中含有闭合质粒DNA。
第五步：
纯化DNA
上清液过柱或酚-氯仿抽提。
第六步：
沉淀DNA
0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。
2基因组或其他DNA的提取
3DNA的定量和纯度测定
4核酸的保存
（1）DNA的保存
最好是溶于TE中，短时间保存可放于4℃冷藏室。
—70℃下DNA能保存5年以上，一般的长期保存只需放于—2
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