整理实时荧光定量PCR的原理及实验Word文件下载.docx

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当所有的taq酶都被饱和以

后，per就进入了平台期。

由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的per反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。

所以，即

使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的dna拷贝数也是完全不一样的，

波动很大（图1）。

图1同一个样本重复96次per的扩增曲线

传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是per的终产物，而不是起始dna拷贝数。

由于per的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的per产物量不能计算出起始dna拷贝数。

对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是per放大之前标本中的dna原始拷贝数，经过per扩增以后的dna拷贝数已经不能反映真实情况。

在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据et值确定dna起始拷贝的数量。

2为什么et值与起始模板拷贝数成线性关系？

et值的定义是per扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

从图1的重复实验中可以直观地看到，尽管平台期dna拷贝数波动很大，et值却是相对固定的。

如果用不同浓度的dna作per，可以看出dna浓度越高，et值越小。

dna浓度每增加1倍，et值减小1个循环。

et值与模板dna的起始拷贝数成反比。

这一结论可以从数学上严格证明。

为使表达式简便，以下推导忽略per效率

等细节。

如果考虑这些因素，可以在方程上增加修正项。

这些修正项的增加并不改变方程的线性性质。

一般地，我们有rn=rb+xo（1+ex）nrs,也就是说第n次per循环时的荧光信号强度（rn）等于背景信号强度（rb）加上每个分子的荧光强度（即单位荧光强度，rs）与分子数目的乘积。

当循环次数n=et时，则有rt=rb+xo（1+ex）etrs。

两边取对数，得log（rt-rb）=logxO+etlog（1+ex）+logrs。

整理此式，etlog（1+ex）=-logxO+log（rt-rb）-ogrs。

G匸log丘占|_只外-log%

『二仏1+叭）硕十石

所以对于每一个特定的per反应来说，ex、rt、rb和rs都是常数，所以et值与logx0成反比，也就是说，et值与起始模板拷贝数（x0）的对数成反比，起始dna浓度每增加1倍，et值减小1个循环。

根据et值的定量是精确和严格的，而传统的终点定量则比较粗放。

如果读者有兴趣的话，也可以假设per的效率（即ex）为100%，从上式推算出定量per标准曲线的最佳斜率和et值的最佳范围。

3怎样确定et值？

实验操作中，et值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的per循环次数（图2）。

基线上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。

阈值所在的横线与per扩增曲线的交点所指的per循环次数就是et值。

基线范围的定义是从第3个循环起到et值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第3到第15个

循环之间。

早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；

而在et值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。

cTis

图2ct值和阈值

显然，ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，ct值是一个完全客观的参数。

ct值越小，模板dna的起始拷贝数越多；

ct值越大，模板dna的起始拷贝数越少。

正常的ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。

4荧光信号和定量数据的归一化

虽然大多数定量pcr仪都会自动扣除本底，但是仍然需要注意荧光信号强度和定量数据的归一化校正，以便不同样本之间的实验数据可以严格地相互比较。

由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因

素对定量结果的影响。

这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红色rox荧光，称为阳性参比信号。

rox在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。

目

标基因和对照基因的信号除以阳性参比信号以后，即rn=r/rrox，就可以在同

样的起点上进行比较和各种计算。

rox校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异（图3）。

图3rox荧光校正（左）和不校正（右）对实验数据的影响

归一后的荧光信号再扣除本底，就得到drn:

drn=rn,样本-rn,空白。

drn是最后构建per实时扩增曲线的纵坐标。

无论绝对定量还是相对定量，在得到实验结果后，还要考虑数据之间的可比性问题。

在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量

的样本所来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/卩或拷贝/ng的定量数据相互之

间实际上并不可比。

只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位

后，才可进行严格意义上的比较。

这种校正可以通过适当的参比来完成。

参比一般选用b-actin、gapdh、rrna

基因等管家基因。

由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。

校正

方法为：

[dna]样本/[dna]ipc，或者det=ct,样本-ct,ipc。

因为ct值与起始dna拷贝数的对数是反比关系，可以证明，这两种计算方法在数学上是等价的。

为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一反应管内同时进行定量测

定，所以这种对照称为阳性内对照（internalpositivecontrol，ipc）。

要进行ipc归一化校正，定量pcr仪必须具备多色检测能力，最好是4色。

否则，目标基因和参比基因只能分两管作定量，就不成其为内”标了。

5污染的预防和热启动

为保证定量的准确性，要预防非特异性pcr扩增和污染。

常用的措施有使用

ung酶（uracil-n-glycosylase）和热启动。

ung酶的作用原理是降解含有du的双链或单链dna。

它在50°

c激活，95°

c灭活。

由于商用per试剂盒均以dutp取代dttp，所以per产物都是含有du的dna链。

在定量per开始前增加50°

的保温步骤，ung酶即可将已有的per产物降解破坏，防止可能造成的污染。

普通的taq酶即使在室温下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入per试剂的过程中、正式per开始前就会完成少量per扩增，增加了背景，影响定量精度。

而金牌taq酶经过特殊修饰，常温下其活性部位被封闭，没有活性；

只有经过95°

e10min的热启动以后，封闭被解除，才能开始dna链延伸，这样就最大限度地减少了杂讯的生成。

6标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照定量实验，误差是不可避免的。

设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。

所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量更应当重复6〜8次，以满足小样本统计的要求。

如果作绝对定量，则标准曲线需要在5个点以上。

标准曲线使用的标准品是浓度已知的dna样本，可以自己制备，也可以购买商品化的试剂盒。

其per反应条件应当与未知样本的一致，以便在同一反应板上同时定量。

阴性对照中不加模板dna,而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在per污染。

阳性对照则用于检验per试剂和实验操作上可能出现的问题。

如果实验中设立了ipe，则ipe既可以用来校正数据，也可以起到阳性对照的作用。

7taqman探针技术原理

taqman探针法是高度特异的定量per技术，其核心是利用taq酶的3'

—5'

外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在taqman探针法的定量per反应体系中，包括一对per引物和一条探针。

探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5'

端标记有报告基团（reporter,r），女口fam、vie等，3'

端标记有荧光淬灭基团（quencher,q），如tamra等。

当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。

随着per的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3'

外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。

所以，每经过一个per循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

信号的强度就代表了模板dna的拷贝数。

TaqMan®

撵针

下游引物

图4taqman探针的荧光信号产生机制

taqman探针根据其3'

端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：

普通的taqman探针和taqmanmgb探针。

mgb探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团（non-fluorescentquencher），本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。

同时探针上还连接有mgb（minorgroovebinder）修饰基团（图5），可以将探针的tm值提高10°

c左右。

因此为了获得同样的tm值，mgb探针可以比普通taqman探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。

因为在模板的dna碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。

实验证明，taqmanmgb探针对于富含a/t的模板可以区分得更为理想。

MinorGrooveBinder

图5taqmanmgb探针

8sybrgreeni荧光染料技术原理sybrgreeni是一种只与dna双链结合的

荧光染料（图6）。

当它与dna双链结合时，发出荧光；

从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分

子的数量。

sybrgreen荧光染料法定量per的基本过程是：

1、开始反应，当sybrgreen染料与dna双链结合时发出荧光。

2、dna变性时，sybrgreen染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成per产物。

4、聚合完成后，sybrgreen染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。

图6sybrgreeni荧光染料与dna双链的结合

sybrgreeni荧光染料能与所有的dna双链相结合，对dna模板没有选择性，所以特异性不如taqman探针。

要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对pcr引物设计的特异性和pcr反应的质量要求就比较高。

在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

9定量pcr仪简介

目前在国内使用得比较多的荧光实时定量pcr仪有美国应用生物系统公司（appliedbiosystems，abi）的7000、5700、7900、7700型和罗氏公司的lightcycler等。

下面以abi最新推出的7000型为例作简单介绍。

7000型荧光定量pcr仪设计满足临床检验、医学研究和基础实验的要求，面向低通量至中等通量的用户。

随机配置的定量pcr引物和探针设计软件primerexpress非常有用，因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量pcr所需的taqman探针。

7000型有实时动态（real-time）和终点读板（plateread）两种运行模式。

实时动态模式用于定量，测定dna或rna拷贝数。

7000型可以动态显示pcr扩增曲线的生成，定量的线性范围大于7个数量级，区分5000和10000个拷贝的dna模板可信度达99.7%。

终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性（snp）分析等。

当然，7000型也可以作为普通per仪使用。

abi已经发布12万个商品化的定量pcr试剂盒，覆盖人类全部4万个基因，平均每个基因3个检测试剂盒，为运用7000、7700、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。

7000型最大特色是具备多色检测能力，荧光检测的波长范围为530〜590

nm,能够有效地分辨famtm/sybr?

greeni、victm/joetm、tamratm和roxtm等荧光染料。

多色荧光检测技术为多重定量、snp分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。

多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。

7000型支持两种定量化学：

taqman荧光探针和sybrgreeni荧光染料。

其熔解曲线（dissociationcurve）功能用于判断pcr扩增反应是否特异，有无杂带生成。

nucleaseasospaiyns.b"

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