细胞工程实验指导级Word格式.docx
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混合母液体积
1LMS吸取单个母液量
1LMS吸取混合母液量
MS大量元素
1
KNO3
1900
20×
19.000
500ml
10×
1000
ml
50ml
100ml
2
NH4NO3
1650
16.500
3
MgSO4·
7H2O
370
3.700
4
KH2PO4
170
1.700
5
CaCl2·
2H2O
440
4.400
2、微量元素母液的配法
微量元素用量甚微，为了提高精确度，混合母液一般扩大为1000倍，因倍数大，故制备体积500ml即可，单个母液可根据实际按照每ml含有某一个便于计算的含量来配制成母液。
按表1-2MS配方中微量元素配方需要量，将各种化合物分别扩大后，用电子天平称取，并分别用100ml烧杯加适量蒸馏水溶解，单个母液按所配制的母液体积定容，混合母液则依次将上述溶液混合于所配制母液体积的容量瓶中定容（其中有的称取量不足以保证精度时，仔细想一想如何达到精度的要求），最后倒入试剂瓶中并贴好标签。
表1-2MS微量元素母液的配制
母液名称
配制
体积
MS微量元素
MnSO4·
4H2O
22.3
1000×
2.230
11.150
1ml
ZnSO4·
8.6
0.860
4.300
H3BO3
6.2
0.620
3.100
KI
0.83
10000×
0.830
0.415
0.1ml
Na2MoO4·
0.25
0.250
0.125
CuSO4·
5H2O4
0.025
100000×
0.0125
0.01ml
CoCL2·
6H2O
3、铁盐母液配法
多数培养基中都有铁盐存在且含量也相同，因为其二价铁离子易被氧化，故与乙二胺四乙酸二钠螯合，配制时先将螯合剂加热溶解后，再迅速称取铁化合物倒入溶解，冷却后定容。
按表1-3MS配方中铁盐所含两种化合物需要量，分别扩大200倍，定容至250ml，倒入棕色试剂瓶中（因铁盐不稳定，易分解），贴上标签。
表1-3MS铁盐母液的配制
浓缩倍数
配制体积
1L培养基吸取量
铁盐
Na2-EDTA
37.3
200×
1.865
250ml
5ml
FeSO4·
27.8
1.390
4、有机物类母液的配法
有机物一般用量甚微且易变质，需单独配制。
配制的母液种类有甘氨酸，维生素B1、B6、VPP、肌醇，一般配制母液浓度为1mg/ml。
其中因肌醇（维生素增效剂）用量相对较大，母液的浓度一般为20mg/ml。
如下表1-4配法。
表1-4各种有机物母液的配制
母液名称
配法
培养基吸取量
甘氨酸（Gly）
1mg/ml
0.050
根据培养基配方中含量分别量取
盐酸硫铵素（B1）
盐酸吡哆醇（B6）
烟酸（Vpp）
肌醇
20mg/ml
1.000
5、植物激素类母液的配法
植物激素类物质也是按照单个母液的配制方法进行。
各种激素主要有细胞分裂素和生长素两大类，一般细胞分裂素（类似）KT、6-BA、6-BAP、2-iP、ZT等先用1mol/LHCl或NaOH溶液适当加热溶解，生长素类（类似物）2.4-D、NAA、IAA、IBA等先用少量95%乙醇溶解，最后均分别配制成1mg/ml的浓度（实际配制时为避免加蒸馏水后又重结晶析出的现象，定容时可将乙醇的含量达到40%左右）。
见表1-5。
表1-5各种激素母液的配制
KT
根据培养基设计含量分别量取
6-BAP
2ip
ZT
0.5mg/ml
2，4-D
NAA
GA3
IAA
五、母液的存放
各种配制好的母液贴上标签，标明母液名称、倍数、日期，置于冰箱中（2-4℃）保存备用。
母液的贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
六、作业
叙述MS培养基母液的具体配法。
实验二培养基的设计与配制
根据培养外植体的类型及其利用目的，了解培养基设计的基本要求及其原则，掌握培养基配制的实验流程以及不同的灭菌方法。
二、实验原理
植物材料（某一特定外植体）培养要获得预期性成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物及其不同外植体要求不同的培养基配方。
因此，在进行大量工作之前，对不同培养基（尤其是植物激素种类及其组合浓度）应进行分析、比较、试验，选择一个符合试验材料需要的适宜培养基。
天平、水纯化装置、高压蒸汽消毒器、pH计或pH5.4-7.0试纸、真空泵、电热搅拌器、微波炉、电炉；
试剂瓶、烧杯（250ml，500ml）、量筒（50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml）、刻度移液管（0.1ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，10ml）或移液器、滴瓶（125ml）；
试管、培养皿、三角瓶、玻璃瓶、丁形瓶、长方形培养瓶、广口瓶、细胞微室培养器皿；
洗耳球、棉线、棉塞、无菌封口膜等。
四、培养基实例
胡萝卜愈伤组织诱导培养基：
MS+2mg/L2.4-D+0.2mg/LKT。
紫花苜蓿叶片胚性愈伤组织诱导培养基：
MS+5.0mg/L2.4-D+3.0mg/LKT+1000mg/LCH，蔗糖3%，琼脂0.65%，pH6.0。
烟草叶片愈伤组织诱导培养基:
MS+1.5mg/LNAA+0.3mg/L6-BAP，蔗糖3%，琼脂0.65%，pH5.8。
五、配制流程：
1、量取或称取培养基基本成分
上一次实验已经制备好的培养基母液从冰箱中取出，分别按大量元素、微量元素、铁盐、甘氨酸、VB1、VB6、Vpp、肌醇以及激素或其它附加成分按顺序排好，分别按MS基本配方准确量取1000ml的实际用量，即不同母液成分的浓度回复到培养基配方含量，最后用蒸馏水定容至培养基配制量近3/10的整数体积（即300mL）。
2、加热溶解琼脂
配制1000ml培养基，准确称取琼脂6.5g（琼脂产品批号不同而异），蔗糖30g（化学纯以上），用蒸馏水定容至培养基用量近7/10的整数体积（即700mL），微波炉加热至完全溶解（电炉加热要不断搅拌）。
3、混合
将上两个步骤混合一起并搅匀，并用蒸馏水定容为1000ml（通常不好定容，为什么？
）。
4、测pH值
按培养基及外植体培养要求调节pH至适合值（若偏大则用1.0mol/LHCl调，偏小用1.0mol/LNaOH调）。
5、分装与封口
分装到培养瓶中，注意每瓶培养基的用量不能太多太少（一般经验为培养瓶中培养基厚度近1.0cm为宜），并也不能使瓶口及内壁接触到培养基液体，要及时封口，否则易引起杂菌污染。
注意：
用各种能用的方法在培养瓶上标记培养基代号。
6、灭菌
灭菌锅有全自动灭菌锅和人工控制手提示灭菌锅两种类型。
灭菌温度为121℃，良好的灭菌效果取决于灭菌温度、气体压力，灭菌时间。
灭菌时间与被灭菌的容积大小有关。
灭菌时考虑时间过长或温度过高的湿热灭菌会引起培养基pH改变（降低0.3-0.5个单位值）；
某些化合物会分解或发生化学反应（太高温度下热压处理会使糖焦化，对培养物可能有毒）；
灭菌时间太长会使盐沉淀下来，会使琼脂解聚；
导致某些有机的生理活性物质的活力下降。
因此，为达到良好的灭菌效果，尽量减少对营养成分的不利影响。
灭菌方法是把分装好的培养基、无菌水及无菌纸放入高压灭菌锅内，锅外层加水后，拧紧锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，开始加热，当温度上升指针移至0.5kg/cm2时，开气阀排除冷气，使压力表指针复零位，按同样方法再排一次冷气，关好放气阀继续加热至1.1-1.2kg/cm2时，保持该压力15-25分钟（温度为121-123℃）后切断电源，打开放气阀，慢慢放热气，锅内蒸汽完全放出，气压归零后打开锅盖，趁热将培养基取出，待冷却后使用。
7、灭菌剂准备
常用的灭菌剂有5%NaClO，5-10%Ca（ClO）2，10-12%H2O2，0.1%HgCl2等，接种材料的灭菌选择某一种即可。
同时，70%乙醇在材料灭菌中常作为增效灭菌剂使用，一般不能缺少。
还有酒精棉球在无菌操作过程中对操作者双手和工作台面的擦拭是必须要用到的。
根据母液浓度，请你写出配制培养基所量取的各种母液种类的精确用量。
实验三植物愈伤组织诱导培养
1．了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求。
2．初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种的无菌操作技术。
3．了解外植体愈伤组织诱导过程。
以植物体中分离出来的器官组织为外植体，在人工培养基和激素诱导下，均可保证离体组织延续生长，产生愈伤组织。
从模式植物胡萝卜直根切下的外植体容易培养产生上述结果，茎叶外植体也可诱导愈伤组织发生。
此外，选取种子胚、茎尖直接诱导愈伤组织也容易成功。
利用比较简单材料掌握培养原理后，再进行困难的实验。
三、实验条件
1．用具器材超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、玻璃记号笔、脱脂棉、加盖小烧杯、废液杯、刀片。
2．药品试剂70%酒精、0.1%升汞溶液（或15%次氯酸钠溶液、15%双氧水）、已灭菌培养基及无菌水、无菌培养皿（垫滤纸）。
3．实验材料新鲜胡萝卜直根、紫花苜蓿叶片、烟草叶片等。
四、实验内容
1．接种前准备
（1）按选用的实验材料事先配好培养基（见上一次实验内容）。
（2）接种前3天用甲醛+高锰酸钾熏蒸接种室进行空气灭菌或空气过滤灭菌。
在进入接种前1个小时对超净工作台进行紫外线灭菌，同时对自身手指甲的清洁。
（3）接种前15-30分钟打开超净工作台开关，台内台面用70%酒精棉球擦拭干净（或喷雾消毒），台面上放置以下用具：
酒精灯、70%酒精、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、无菌培养皿（内垫湿润滤纸）、培养基、已经前处理的接种材料。
2．培养材料灭菌
培养材料灭菌是接种准备中的重要环节，一方面要考虑灭菌剂的杀伤效力，同时，也要考虑植物材料的受损情况，所以灭菌时间长短很重要。
灭菌时，将选出的健壮无病幼嫩的茎叶材料进行处理，然后放入加盖小烧杯中。
一般的消毒程序如下：
将带外植体的材料在自来水下充分洗净或枝条在实验室条件下萌发新的茎叶→剪取健康无破损、完整的新叶片外植体放入灭菌杯中→70%乙醇浸泡5s→倒掉→0.1HgCl2灭菌8-10min（选用其它消毒剂时要长一些）→倒掉→无菌水冲洗3-5次。
3．接种
（1）接种前用肥皂洗手（穿工作服，戴口罩和工作帽），然后用70%酒精棉球擦手表面消毒。
（2）将超净工作台上培养瓶的封口橡皮筋打开，整齐排列在接种台的左侧。
（3）点燃酒精灯，将所用镊子、刀在用酒精棉球擦拭后，在酒精灯火焰上灼烧灭菌，灼烧灭菌后放在支架上以防再污染。
在整个接种过程中，应每隔一段时间便将刀、镊子沾酒精灼烧一下灭菌，冷却后再用（或用无菌水快速冷却）。
（4）打开无菌培养皿包装，置于操作台上操作者的正前方。
（5）外植体处理：
用无菌镊子取出材料，置于培养皿中滤纸纸上吸水并进行切割。
较细的茎段切成1cm左右长，较大的块根或茎用解剖刀切成一系列2~3mm左右厚的薄片，每片切成通过形成层的5mm见方的小块，这样每块外植体都包含韧皮部、形成层和木质部三部分，其外植体大小及厚度尽量一致。
；
嫩叶切成1cm2大小；
较大的种子用无菌解剖刀和镊子轻轻剥去种皮，小心切下胚，去掉胚乳，较小的种子在无菌纸上沥干水分即可。
（6）在酒精灯上方，左手握住培养瓶，右手轻轻打开并拿掉封口摸（包头纸），将纸盖外面朝上置于台面上。
右手用镊子将茎段、叶或切片平摆放于培养基表面，胚或种子平放或斜插均可，轻轻按住外植体使其接触培养基。
注意接种材料要摆放均匀且保持一定密度，完毕后将培养瓶瓶口在酒精灯火焰上灼烧一下，然后用封口，拴紧，并用玻璃记号笔在瓶下方注明材料代号、培养基代号、接种日期及姓名等。
（7）将培养基放入培养室指定培养架上培养。
注意在超净工作台上接种时，应尽量避免说笑，打喷嚏。
打开瓶培养时，注意不要污染瓶口，并进行瓶口灭菌。
另外还应注意，手臂切勿从培养基、无菌材料、切割用的无菌纸、接种器械上方经过，以避免再度污染。
接种要点是“轻拿轻放，不许说话；
瓶口倾斜，不离火焰；
揭膜盖膜，顺其自然”。
五、培养观察
培养瓶在25±
1℃培养室或光照培养箱中，接种后一周内，如有污染情况即可观察到，真菌污染菌丝清晰可见，呈黑、白各色。
如细菌污染，为粉红、白色或黄色粘稠菌斑，发现污染应及时转移未污染材料或处理掉。
未污染培养2-4周后，可在外植体或其切口处观察到已长出的疏松呈颗粒状愈伤组织，继续培养并从愈伤组织块的质地、色泽和大小等指标进行详细的观察。
对接种后的培养物进行观察是评判接种操作水平高低的标准，同时也是实验科学的重要内容，只有在观察中发现问题，如培养基的设计是否正确、培养条件是否适合、培养物的生长发育从小到大的变化特点等。
1.无菌操作技术要点是什么？
2.记录接种情况并统计愈伤组织出愈率及污染情况。
实验四愈伤组织增殖与分化培养
观察和分析不同光照条件下形成的愈伤组织对器官分化的影响，观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异，了解愈伤组织增殖培养及其器官分化和植株再生的过程。
由离体培养愈伤组织细胞再生成完整植株有两种不同方式：
一是通过茎芽分化，再诱导生根，形成小苗；
二是通过体细胞胚胎发生形成小苗。
前者是一种单极性结构，后者是一种双极性结构。
二、实验材料
诱导的不同类型的愈伤组织。
三、培养基
配制增殖培养基、分化培养基。
四、实验操作方法
（1）观察愈伤组织诱导结果：
统计愈伤组织诱导率，观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析。
愈伤组织形成率＝愈伤组织数/接种外植体数×
100%
（2）按照无菌操作进行转接。
（3）将光照下诱导的愈伤组织，全部转入分化培养基上，黑暗诱导的愈伤组织一半转入分化培养基，所有转入分化培养基的愈伤组织均置于连续光照或16h/d光照，温度25±
1℃条件下培养。
实验中需要注意的是，愈伤组织的状态常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后3～4周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有明显变化，应及时调整培养基激素浓度，更换新鲜培养基。
（4）将黑暗下培养的另一半愈伤组织转入增殖培养基中，继续置于黑暗条件下培养，培养温度25℃左右。
五、实验记载内容
接种瓶数，每瓶接种量，统计愈伤组织分化率，描述不同光照形成的愈伤组织状态、大小。
从培养基设计、培养过程方面叙述愈伤组织诱导与分化培养的主要区别与培养过程中应注意的问题。
实验五悬浮细胞培养
了解液体培养建立细胞悬浮培养系的过程,学习细胞密度的测定方法与单细胞培养的几种方式。
在摇动的液体培养基中做植物组织培养，可以消除许多在固体培养基上培养的不利之处，培养物在液体培养基中的运动促进气体交换，消除了由于重力而产生的组织极性，也消除了培养基中和细胞表面的营养梯度。
在摇床上摇动液体培养基，培养疏松易碎愈伤组织，最终将产生由单个细胞或由2-10多个细胞团组成的、能活跃生长的细胞悬浮液。
细胞悬浮培养体系的建立,为遗传工程技术提供了细胞水平的理想材料。
三、实验用品
1、用具器材：
超净工作台、摇床、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、记号笔、脱脂棉。
2、实验材料及培养基：
烟草愈伤组织的细胞悬浮培养基（见附表2）
1、配制液体培养基。
将配制好的液体培养基装入三角瓶，然后按常规培养基灭菌方法灭菌；
若培养基中含有不宜于高温灭菌的成分则应采用过滤灭菌法，在超净工作台上倒入已灭菌的50ml空三角瓶，每瓶约20-25ml。
2、单细胞的机械分离。
取出已诱导产生的疏松易碎愈伤组织转入液体培养基中（以每克愈伤组织加4-8ml液体培养基为宜），放在25℃黑暗或弱光条件下，用摇床培养（80-100rpm）。
3、悬浮细胞过滤与单细胞收集。
愈伤组织在液体培养基中连续振荡7-10d后，用细胞筛过滤（根据单细胞体积大小而定，大细胞用200-300目，小细胞用400目）到离心管中，500rpm离心5-10min收集单细胞。
4、细胞密度调整。
培养细胞密度一般应在105-109/ml。
5、测定活细胞百分率。
一个良好的悬浮细胞液可达60%以上。
测定时配制0.1%酚藏花红溶液（培养液为溶剂）；
丙酮配制的二醋酸酯荧光素母液（5mg/ml）储存在冰箱中，使用时稀释至0.01%。
观察时将细胞与二醋酸酯荧光素溶液在载片上混合后，再滴一滴0.1%酚藏花红染液，盖好盖片，在显微镜上观察，酚藏花红使死细胞染上红色，活细胞不被染色，因此在显微镜上可分别计数。
15-30min后还可在相差显微镜和荧光显微镜下观察，若细胞被二醋酸酯荧光素所染，则显示活细胞的特征，死细胞不显示荧光反应。
6、培养方法。
（1）液体浅层静止培养：
方法是将一定密度的游离细胞悬浮液置于培养皿中，在培养室内静置培养。
优点是培养物于空气接触面较大，细胞代谢物易于扩散，防止了有害物质积累而对培养物产生毒害，转移培养物或添加新鲜培养液也方便，并便于观察与照相；
缺点是容易造成游离细胞局部密度过高或过低，致使密集细胞联成片的现象，影响细胞分裂，也不易于定点观察。
（2）固体平板培养:
先将悬浮培养液调整到最终所要求的植板密度的2倍，然后把相同的培养基但已经加入琼脂的培养基融化，冷却到35℃，置于恒温水浴锅中保持不变，加入等量的悬浮培养液混合，迅速铺展在培养皿中，厚度约1mm。
最后用石蜡膜带封口，在25℃下黑暗培养。
此法能使游离细胞分布均匀，便于定点观察细胞生长发育情况，但发育速度较慢。
（3）双层培养：
在培养皿内先铺一层琼脂固化培养基，然后在上面滴加细胞悬浮液。
好处在于固体培养基中的养分可以不断向液体培养基中释放，培养基也不会失水变干。
（4）悬滴培养：
滴加0.05-0.1ml的游离细胞悬浮液滴到培养皿上，然后把培养皿翻转过来，使这些小滴悬在培养皿上。
这种方法适合于细胞密度较低时使用，可以设计几个不同的培养基处理，同时接种在培养皿里，以便在相同条件下培养，进行严格比较。
注意保持培养皿湿度，防止小滴因蒸发过快而干涸。
（5）看护培养法：
把一块8mm见方的灭过菌的滤纸片，无菌条件下放在一块活跃生长的愈伤组织的上面，然后再把一个单细胞置于其上。
（6）微室培养法：
从悬浮液中取出只含一个单细胞的培养液，置于一张无菌载片上，在培养液的四周隔一定距离加上一圈石蜡油构成围墙，然后再在其左右各加一滴石蜡油，每滴之上置一张盖片作为微室的支柱，又将第三张盖片架在两个支柱之间，构成微室的屋顶，最后把整张载片置于培养皿中进行培养。
五、观察与结果
通常，每隔7d继代培养一次，在上述条件下经3-4次继代培养后，胡萝卜悬浮培养物已分散成单细胞和小细胞团集合体。
悬浮细胞的生长速度与接种时的细胞密度有关。
因此，测定接种细胞密度非常重要。
如接种物密度低于最适量时，细胞生长较慢或不生长；
反之，细胞的对数生长期缩短，这些培养物的生长速率较早降低且停止生长。
就胡萝卜细胞悬浮液而言，细胞密度为105-3×
105个/ml或接种物鲜重100-300mg接种到60ml培养基中适宜。
（一）培养细胞的计数方法
细胞计数一般用血球计数板,按一定计数方法进行计数。
血球计数板是一个特制的载玻片。
每个划线区由“井”字形粗线分成9个区域。
每个区域长1mm，宽1mm，凹槽深度为0.1mm，体积为1mm2×
0.1mm即0.1μl。
每个区域又可划分
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