食品微生物检验文档格式.docx
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二、实习过程概述
12.15上午举行动员大会
12.16至12.18查找资料并设计实验方案。
12.19上午提交实验方案并通过了,再去领实验器材,下午做预备实验,并配制LB、PDA培养基,灭菌,晚上倒平板,做无菌检查。
12.20样品中细菌和霉菌的检测进行十倍稀释、接种
12.21细菌菌落的观察及计数,配制LB、孟加拉红、乳糖发酵培养基,灭菌,倒平板,十倍稀释,接种。
12.22观察乳糖发酵试验以及观察细菌菌落和计数,配制EMB培养基,接种。
12.23观察霉菌菌落和计数
12.25观察酵母菌落和数,EMB纯化培养
12.26观察大肠菌群的菌落
12.27--12.31数据的处理分析,完成实习报告。
三、实习内容
油豆腐中细菌含量的测定:
一、实验材料
1、电热恒温培养箱、冰箱、托盘天平、电磁炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、精灯酒、研钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄
2、培养基和试剂:
75%乙醇、生理盐水、1mol\L氢氧化钠溶液、LB培养基、检验方法
2、检样稀释及培养
(1)以无菌操作,将检样油豆腐25g剪碎、研磨以后,放于盛有225ml无菌水的三角0瓶内,并在三角瓶中放入玻璃珠,经充分振摇做成1:
10的均匀稀释液。
(2)用1ml无菌吸管吸取1:
10稀释液1ml,沿管壁缓慢注入含有9ml无菌水的无菌试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液,下同),振摇试管混合均匀,做成1:
100的匀液。
(3)另取1ml的灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次,即换用1支1ml灭菌吸管。
(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择3个适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于无菌培养皿内,每个稀释度作三个培养皿。
(5)稀释液移入培养皿后,应及时用L型玻棒在培养基表面将样品均匀涂布。
(6)等琼脂凝固后,翻转培养皿,置(36±
1)℃恒温箱内培养24h取出,计算平板内菌落数目乘以倍数,即得1g样品所含菌落总数。
二、菌落计算方法
(1)菌落计数方法
做平板菌落计数时,可用肉眼观查,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
(2)菌落计数的报告
①平板菌落数的选择
选取菌落数在30~100之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用三个平板,应采用三个平板平均数,其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而其余的一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线),若仅有一条链,可视为一个菌落数;
如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计。
②稀释度的选择
应选择平均菌落数在30~100之间的稀释度,乘以稀释倍数报告之。
若所有稀释度平均菌落数均大于100,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30~100之间,其中一部分大于100或小于30时,则以最接近30或100的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
实验具体流程如下:
下表为实验时记录的绿豆糕中细菌的含量数据:
样品中细菌的含量
稀释度10-210-310-4
平板一729无
平板二81111
平板三10521无
平均菌数
(个/g)3.44×
1045.4×
1041.3×
104
注:
每个平板加入1ml的稀释液
其中,细菌菌落全为白色。
二、油豆腐中霉菌和酵母菌含量的测定
1、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
1.1冰箱:
2℃~5℃。
1.2恒温培养箱:
25~28℃。
1.3电子天平:
感量0.1g。
1.4无菌锥形瓶:
容量500mL、250mL。
1.5无菌广口瓶:
500mL。
1.6无菌吸管:
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
1.7无菌平皿:
直径90mm。
1.8无菌试管:
10mm×
75mm。
2、检验程序
3操作步骤
3.1样品的稀释
3.1.1样品预处理:
以无菌操作,将检样油豆腐25g剪碎、研磨以后,放于盛有225ml无菌水的三角瓶内,并在三角瓶中放入玻璃珠,经充分振摇做成1:
3.1.2取1mL1:
10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:
100稀释液。
3.1.3按3.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管。
3.1.4根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于3个无菌平皿内。
同时分别取1mL样品稀释液加入1个无菌平皿作空白对照。
3.1.5及时将15mL~20mL冷却至46℃的PDA或孟加拉红培养基(可放置于46℃±
1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
4结果与报告
4.1计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
4.1.2若所有平板上菌落数均大于150CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4.1.3若所有平板上菌落数均小于10CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.1.4若所有稀释度平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算;
如为原液,则以小于1计数。
4.2报告
4.2.1菌落数在100以内时,按“四舍五入”原则修约,采用两位有效数字报告。
4.2.2菌落数大于或等于100时,前3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数来表示结果;
也可用10的指数形式来表示,此时也按“四舍五入”原则修约,采用两位有效数字。
4.2.3称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告,报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
A.1PDA培养基
A.1.1成分
马铃薯(去皮切块)150g
葡萄糖10.0g
琼脂10.0g
氯霉素0.05g
蒸馏水1000mL
A.1.2制法
将马铃薯去皮切块,加1000mL蒸馏水,煮沸20min。
用纱布过滤,补加蒸馏水至1000mL。
加入葡萄糖和琼脂,加热溶化,分装后,121.1℃灭菌20min。
倾注平板前,用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中,并加入抗生素抑制细菌的生长。
油豆腐中酵母菌检验的流程:
油豆腐中霉菌的检验流程:
下表为实验时记录的绿豆糕中霉菌酵母菌的含量数据:
样品中酵母菌的含量
稀释度10-110-210-3
平板一58132
平板二377无
平板三629无
(个/g)4.2×
1027.7×
1025.3×
102
每个平板加入0.5ml的稀释液
酵母菌菌落呈白色,且表面很潮湿。
样品中霉菌的含量
平板一122无
平板二233无
平板三176无
(个/g)3.4×
1037.3×
103/
霉菌菌落有菌丝,菌落较大,有白色、黄色、黑色的菌落。
三、油豆腐中大肠菌群的测定
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1设备和材料
1.1温箱:
36±
1℃。
1.2冰箱:
0~4℃。
1.3恒温水浴:
44.5±
0.5℃。
1.4天平。
1.5乳钵。
1.6试管。
1.7吸管。
1.8广口瓶或三角烧瓶:
容量为500mL。
1.9玻璃珠:
直径约5mm。
1.10酒精灯。
1.11试管架。
2培养基和试剂
2.1乳糖胆盐发酵管:
按GB4789.28中4.9规定。
2.2伊红美蓝琼脂平板:
按GB4789.28中4.25规定。
2.3乳糖发酵管:
按GB4789.28中4.10规定。
2.4磷酸盐缓冲稀释液:
按GB4789.28中3.22规定。
2.5革兰氏染色液:
按GB4789.28中2.2规定。
3.1检样稀释
以无菌操作将检样25g放于有225mL无菌水的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠),经充分振摇或研磨做成1:
3.2乳糖发酵试验
分别取1ml1:
10的均匀稀释液于9个乳糖胆盐发酵管内,置36±
1℃温箱内,培养24±
2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±
1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±
1℃温箱内培养24±
2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4大肠菌群
4.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±
0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±
2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;
如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2结果报告
下表为实验时记录的油豆腐中大肠菌群的含量数据:
1.乳糖发酵罐现象
9只试管中有一支产生气泡,所有的试管都由蓝色变成黄色。
注:
每只试管加入1ml稀释液,产气的现象为杜氏小管中有气泡产生,产酸的现象为培养基颜色由蓝色变为黄色。
2.EMB平板分离现象
每个平板加入1ml
平板
现象
镜检结果(革兰氏染色)
乳糖复发酵结果
试管二
有金属光泽的深色菌落
革兰氏阴性短杆菌
产酸,产气
试管二稀释10倍
试管三
有金属光泽的深色菌落
试管三稀释10倍
革兰氏阴性短杆菌
产酸,产气
试验结论:
油豆腐中检测出无大肠菌群。
四、实验经验与心得总结
一、微生物实习过程中心得体会:
1、实习中我们需要树立安全第一的思想,服从领导,尊重指导教师,认真学习,勤于思考!
2、在实习过程中应充分考虑到所处环境与设备的条件,适当更改实验方案,使实验更加合理可靠!
3、在实习过程中,我们应充分考虑到平板涂布时所加入的稀释液的量,太少会使菌落数过少,不利于计数;
太多则会导致倒置培养的不便,并会是菌落数过多。
还有就是要考虑好稀释度的问题,不同的样品不可相同,稀释度过高,会导致菌落数过少,稀释度过低则会导致菌落数过多,不利于计数,也容易导致误差,所以,在这两个方面,是需要我们重点考虑的!
4、在实验过程中,我们要注意灭菌和无菌操作的重要性,尽量避免杂菌污染,导致实验误差!
5、每次实验结束时,都需要整理好自己所负责的台面卫生,确保实验室的安全整洁。
6、涂布的时候要均匀,不然菌落生长不均匀。
7、样品预处理时一定要处理的妥当。
二、试验中存在的不足与建议:
1、实验室的样品试剂需好好保存,每次用完后都需盖好放回原处好好保存,防止变质。
2、在做细菌的实验时,我们组做了两次,第一次是因为涂布不均匀,导致菌落只有一处生长,计数无法进行,于是我们将这个实验都重新做了一遍,在做实验时,应该充分考虑到样品的特性,从而设计出合理的实验方案。
3、在做大肠菌群的测定时,杜氏小管需用注射器注满培养基,再倒置后缓缓放入试管中,切忌不可垂直丢入,这样很可能会导致试管破裂,杜氏小管注射培养基时,需注满,不然,放入试管后会导致小管内出现气泡,影响实验结果!
总的来说,这次的微生物课程实习,让我学到了很多,比如说怎样设计实验方案以及团队精神的重要性、操作时操作技术日渐成熟等等,而且,这次的课程实习,让我对自己的实验动手能力有了一个新的认识和提高,能更深刻的认识到自己实验过程中不足的一方面,让自己在日后的学习中能更好地运用操作实验,对自己日后的发展打下了坚实的基础!
五、课后思考题
1、用滤膜法检测大肠菌群有什么优点?
答:
(1)与直接法比较可以检测大量的样品。
(2)浓缩效应使微生物的检测结果提高。
(3)带有菌落的滤膜可作为检测的永久记录存档。
(4)可见的菌落与样品量直接对应,得出定量结果。
2、检查豆制品中的大肠菌群有何意义?
主要是以该菌群的检出情况来表示豆制品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
实习报告书写要求
每次实习结束后,每个学生应按时写出实习报告。
一、实习报告内容提纲
1、实习时间、地点和实习单位;
2、实习过程概述;
3、主要实习岗位和实习内容;
4、实习收获和重要心得体会;
(不少于300字,每个人体会不同,雷同重写)
5、存在不足和建议;
6、其他。
二、排版要求
1、统一用A4纸打印;
2、页边距25mm,小标题用四号黑体字,正文内容用小四号宋体,行间距固定值24;
插入页码居中,
3、其他参照有关编排规范进行。
注意:
1、学生姓名一栏请注明姓名及学号,如张三(0000001)
2、实习报告提交时间为2013年1月11日