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外周血细胞形态学检验及技巧

外周血细胞形态学检验及技巧外周血细胞形态学检验及技巧

卫生部北京医院血液科郑天林卫生部临床检验中心彭明婷谷小林陆红

一.血液学及血细胞形态学临床应用：

•是临床血液病诊断与治疗及临床医学检验学的基础工作。

•血细胞形态学适用于临床血液病诊断快速简捷的要求。

•近年来由于血细胞学及超微结构、免疫学、细胞遗传学、融合基因、造血干细胞及其细胞因子、骨髓造血微环境、基质细胞、树突状细胞、淋巴系细胞发生及其疾病表现，细胞增殖动力学与细胞凋亡以及骨髓组织病理学应用，推动了血液的临床与实验室的新知识迅猛发展。

•当前血液病不能单凭临床与形态学作

出诊断，必须以临床和血细胞形态学为基础，将免疫学、细胞遗传学及分子生物学新知识、新技术应用到血液学中，构成现代临床血液学与分子生物学诊断技术，弥补形态学的经验性与主观性带来负面缺陷，才能提高血液病的诊断与治疗水平。

•进入90年代以来，国内外采用多学科联合技术综合诊断技术与方案：

OFAB-AL（1976）、NCL（美国国家癌症研究所）对FAB-AL分型的补充（1995）、AL-MIC分（类）型，MIC及MICM分型（1985-1990）；

OFAB-CL分型（1989）、中国CL分型（1997）；

OFAB-MDS分型（1982）、MIC协作

组对FAB-MDS分型提出补充建议（1987）；

OWHO对造血系统及髓系恶性疾病和淋巴系恶性肿瘤WHO分类（2000）；

•血细胞形态学诊断技术正在进入显微图象软件时期：

O创造出许多多功能软件，如血细胞形态学、细胞化学染色、血液病诊断与鉴别诊断、CL诊断与治疗及教学系统多媒体软件等。

O将显微镜与微机相连，应用储存、分类、检索软件，编辑、打印诊断报告，并可附多幅细胞图象。

二．血细胞形态学基本概念

血细胞形态学作为临床血液病基础诊断：

•观察血细胞形态和数量及其比例的变化来研究造血器官的结构和功能是血液学的重要组成部分，是诊断造血系统疾病最基本、最简便实用的检查方法，被临床普遍应用。

•正常人的血液及造血器官中，各种血细胞的数量有一定的正常范围，不同血细胞及细胞

发育的不同阶段有一定形态结构特点。

•在造血系统疾病中，如果造血功能发生紊乱，就会从血细胞形态学的量变和质变中反映出来。

•血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分组成，必须平行进行检查。

因为，外周血的血细胞改变往往反映骨髓病变的信息，才有利于诊断。

三．血细胞染色

（一）细胞染色机制：

染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用，使其清楚显示细胞各个组成部分，有利辨识细胞形态。

染色可分二个步骤：

1．染料受相应物质吸附而附着于物质表

面；

2．固着作用，即染色粒子进入细胞内起化学反应（染料透过细胞膜的学说很多，尚无定论），与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。

染色剂皆有选择作用，其染色不是将细胞全部一齐着色，而只是将其中一部分染色，多余的被冲洗掉。

目前多以吸附学说（电力吸附、机械吸附、化学吸附）来解释。

•一般染色方法由两种染色剂（酸性、碱性）组成，通常细胞核及浆碱性粒体为碱性，细胞浆为酸性。

酸性染料可和带正电荷的（碱性）物质结合，这种物质称嗜酸性物质，对酸性染料具有亲和力，因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质；碱性染料可和带负电荷的（酸性）物质相结合，这种物质称嗜碱性物质，对碱性染色粒具有亲和力，因此嗜碱性粒细胞之颗粒本身为酸性物质。

另一种蛋白质在pH6.4呈等电状态，本身所含的正/负电荷相等，因此，既能和酸性染料又能和碱性染料结合，这种物质称中性物质，如中性粒细胞之颗粒。

•一般用pH6.4PBS来稀释染液，使每次

染色都在同一pH中进行，让细胞在恒定条件下着色，使染色效果趋于一致

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2外周血细胞形态学检验及技巧

染液过碱时，蛋白质带有负电荷，对次甲蓝有色部分的正电荷吸附力强，因此染成的细胞一般着色较蓝，说明pH不适合。

•染色与固定亦有极大关系，因细胞经固定后，其蛋白质的电力吸附（电附）可能有变化，有些固定液能将细胞某部分的电附加强，使其染色更为容易。

因此，这种固定剂不仅有固定作用，也有媒染作用（Mordunt），染色极为容易。

因此，电附是染色过程中最重要的作用。

机械吸附在染色过程中也参与作用，如用苏木液和伊红染色，细胞核不是纯蓝色，蓝色中略有红色，胞浆也不能尽为红色，红色中略有蓝色或两者皆带些紫色。

这是因为伊红与胞核虽无电附仍有机械吸附，故也能染上少量红色，苏木液与胞浆虽无电附但也有机械吸附，因而胞浆略显蓝色。

化学吸附（作用）在染色中应用，最早应用于金属染色剂（氯化金、硝酸银等）的金属与细胞内物质起化学作用，使金属在细胞内变成沉淀物或死亡物，显示细胞结构或物质。

近年来此原理用于细胞酶化学染色。

•血细胞的染色多采用瑞氏染色和姬姆萨染色两种，但作者取其两种染色的优点，采用瑞氏和姬姆萨混合染色法，比单用一种染色法更佳。

但近年来也出现一些快速和改良染色方法及染色液商品化，对血细胞形态染色不一定适用。

（二）瑞氏（Wright'sstaim；美蓝－伊红Y）染色：

1．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlemblue）和酸性染料黄色伊红（EostmY）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝—伊红Y）染料。

伊红钠盐的有色部分为阴离子，无色部分为阳离子，其有色部分为酸性，故称伊红为酸性染料。

美蓝通常为氯盐是碱性的，美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐，其有色部分为阳离子，无色部分为阴离子，恰与伊红钠盐相反。

2．用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。

甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：

（1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。

甲醇

ME（瑞氏染料）

在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。

（2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。

3.瑞氏染液配制：

（1）瑞氏染液配制：

瑞氏染料830gm或1g

甲醇（AR）500ml或600ml

先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

（2）缓冲液：

1）缓冲液作用：

染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。

缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH一般在6.4~6.8，偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。

2）缓冲液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：

配方1：

配方2：

ml

1%Na2HPO420mlM/15Na2HPO426.5ml

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3外周血细胞形态学检验及技巧H2O（新鲜）加至1000ml置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。

（四）姬姆萨（Giemsa'sstain；天青-伊红）染色

1．姬姆萨染料是天青（蓝）2号伊红

AzurIIEqsin）和天青（蓝）2号合成的。

2．姬姆萨红染料（Giemsa,天青-伊红）染液配制：

姬姆萨红染料（粉末）0.5g或7.5g甲醇（AR）33ml或500ml甘油（AR）33ml或500ml

先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研

磨溶于甘油中，置于56°C水温箱内，90〜120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。

此染液放置室温阴暗处，时间越长越好。

使用染液9临时配置）：

姬姆萨染液

1ml，加DDH2O10ml混匀。

即可使用

3．染色步骤：

1）先用甲醇固定2〜3分钟

2）将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用

液15〜30分钟

（3）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。

（五）瑞氏及姬姆萨染色液的鉴定：

刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定：

1．取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。

2．取1滴染液加1滴缓冲液，染液由深蓝色立即变为紫红色。

3．取血片或骨髓片进行试染检查，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况，pH是否合适及染色合适时间。

如有上述变化，表明染液合格，可供使用。

（六）瑞氏染色（Wright's）-姬姆萨（Giemsa's）混合染色：

瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差,而姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰,色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差故采用以瑞氏染液为主姬姆萨染液为辅的混合染色。

染色步骤:

1.先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；

2.稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减（根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定）；

3.稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入；

4.染色30-40分钟；

5.分色：

用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上,待干，勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。

四．血液学及血细胞形态学内容及自身特点：

八\、•

（一）血常规检查（Hb、RBC、WBC、Plt、血细胞比积、RBC-MCV、MCH、MCHC及血小板容积曲线），用自动化仪器提高工作效率，为使结果准确可靠，必须建立监测方法，搞好质控，此属数值质控。

我国已较普遍开展全国、省、市（地区）质控。

但普遍存在应付质控质量的问题，并未能切实解决自身质控问题。

（二）白细胞分类：

白细胞分类的自动化已普遍应用，只能为患者普查与筛选之用。

遇有问题应用显微镜观察，弥补自动化仪器缺陷。

一般医院显微镜档次偏低，分辨率低，正确使用和维修欠缺，因而要更好地发挥光镜的观察效应。

（三）骨髓、外周血细胞形态学及分类，是血液病及临床各科患者基本检查及诊断依据。

反映继发性疾病的血液学表现，了解机体状况、感染（细菌、病毒、寄生虫等）等改变。

（四）血细胞涂片自身的特点：

1．涂片不易均匀：

由于血液是混悬液，其中白细胞、有核细胞、RBC、血小板的形态大小、比重及生物活性和血浆成分等的不同和制片技术差异、质量分布不均匀性差异颇大。

2．细胞分布和检查的非随机性：

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4外周血细胞形态学检验及技巧

（1）细胞分类标准与观念不一；

（2）采样和计数100~200个白细胞的局限性；

（3）细胞分布的生理变动；

3.与疾病的相关性；

4.室内、室间分类不一致性，开展室间质控也是促进形态学提高重要手段。

（5）血细胞形态学（外周血及骨髓）质控：

自1983年以来，澳大利亚皇家病理学质控中心和英国皇家进修学院WHO质控中心及最近美国洛杉矶质控中心，国内：

全国及省地市也普遍开展，由质控标本涂片发展图片指定细胞识别。

五．血细胞形态学采样、制片染色与检查要

求：

（一）采样、制片及染色，三道工序至关重要，是细胞形态学检查的成败关键。

要得到合格的涂片标本，做好上述工序，应注意以下要求：

1.采样、制片：

（1）玻片要求：

国内1.0mmx26mmx76mm±0.5，美国NCCLS规定1.0mmx25mmx75mm±0.5，要严格清洁，接近中性.

（2）推片：

选择优质推片，推片两端边缘整齐、平滑。

也可选用有机玻璃，其大小、厚度与坡片相同，两端之边缘应加工光滑，以利推片用。

（3）采外周血（样），擦去第一滴血，迅速采血，量适中，如绿豆粒大小，具有一定推片技术，推片倾斜45°±，推成血膜长度25mm〜35mm，宽度18〜20mm，血膜四周留有空隙区，血膜终尾离玻片终端至少10mm，血膜均匀，薄如蝉翼，尾端形如弧状，迅速扇（摇）干，血膜具有头、体、尾不同厚薄区域。

此外，涂片时，还要考虑患者的血液状态，如贫血程度、血液粘稠度、WBC或有核细胞多少等因素，调整推片技巧。

（4）如若采用静脉血推片，用K3-EDTA或肝素抗凝，推制血片应尽早进行（最迟在1〜2小时内）。

（二）染色：

是识别细胞形态的重要标记工序：

常规瑞氏-姬姆萨染色要点：

1．要得到满意、漂亮的血细胞染色标本，新鲜涂片迅速染色是很重要的。

2．染色液配制要合格；

3．涂片切勿用甲醛固定，否则不着色；

4．染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持玻片染色液面的张力等染色技巧均有重大关系。

染液要覆盖涂膜面，再加缓冲液（1:

2），其量要充足、混均，

染色时间要30分钟以上

5．细胞着色的观察：

（1）当染液与缓冲液混合后，甲醛吸水液温升高，发生剧烈反应，直至液膜表面的“染色粒”呈均匀分布，随染色时间的推延，“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”，逐渐由外缘向内缘推进至染色面中心（此过程需要20-30分钟以上），则表明细胞着色已完成，

（2）再用自来水缓流冲洗，使染色液沉渣及染色粒浮去，使其充分起分色作用，去除细胞染色中浮色，显示出胞核结构及细胞清晰形态，待干，镜检。

六．外周血细胞形态检查技巧：

外周血中三种血细胞数与形态学表现是：

•反映骨髓造血状态及血液病和其他疾病的厨窗；

•是检查与观察疾病的重要指标；

（一）WBC形态学诊断技巧：

1．WBC数值准确性估计：

（1）目前自动化计数仪时有出现结果的偏差，低倍镜观察血涂片可以粗略估计WBC数值及分布。

低倍视野WBC数：

正常约3~5个，增多6个以上，减低3个以下。

（2）WBC如推至片尾，分布不均，估计将有一定难度。

较大的细胞如单核、异淋及中性粒细胞及不成熟细胞多在片尾，体部则多为较小的淋巴细胞，使分类造成偏差，所以分类部位在适当调整。

2．白细胞计数值限度分级：

（1）WBC正常范围：

4.0〜10.0X10

9/L;

（2）WBC正常限度以下:

•轻度减少（<4.0〜3.0X109/L）,

•中度减少（<3.0〜2.0X109/L）,

•极度减少（<2.0X109/L）;

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5外周血细胞形态学检验及技巧

20.0X109

（3）WBC正常高限度以上

•分轻度增多（＞10.0〜

/L）,

•中度增多（>20.0〜40.0X109/L）,

•明显增多（>40.0〜80.0X109/L）

•极度增多（>80.0X109/L）。

以此与所测知WBC计数值作粗略对比，推断WBC计数值的准确性。

（4）如在血片分类计数过程中发现较多有核红细胞时，

•计出血片中有核红所占%率，即以校正原WBC计数值减去有核红所占比例，求出外周血中WBC总数值，

•另作WBC分类计100个过程中遇到多少有核红细胞，即有核红细胞个/100个WBC，

•或作血片有核细胞分类计数（包括有核红细胞），计出有核红细胞所占%率。

3．WBC分类正常范围及其病理性改变：

（1）WBC分类正常范围：

•新生儿出生后最初24小时白细胞数高，主要为中性粒细胞，至第3〜4周，中

性粒细胞与淋巴细胞比例倒转，直至4岁淋巴细胞比例仍多。

表1

•白细胞分类正常范围由于民族、地区、年龄、性别及其生理性变化的影响，以及检查本身的技术差异，即使一人同次取材不同涂片、一张涂片多次分类计数结果也不可能完全一致，但不可差异太大。

•分类中占大比例的中性粒细胞或淋巴细胞呈正态分布，占小比例的嗜酸/嗜碱性粒细胞及单核细胞则为Poisson分布。

2）病理性形态学改变：

1中性粒细胞：

•中性粒细胞分叶分化程度，被认为从干细胞至粒细胞生成是否正常及与粒细胞年龄相关；如核分叶不良，Pelger-huet现象；核仅一叶或二叶，其百分率增加时谓之“左移”，反之，多数细胞四叶以上谓之右移，一般认为正常中性粒细胞胞核分叶情况：

4叶者为15〜25%3叶者为40〜

50%

2叶者为20〜40%1叶者为<5%

血象中如有多个5叶以上者提示有巨幼细胞性贫血的可能。

右移现象

—多见于巨幼细胞性贫血、肝脏疾患，并可以5叶与4叶所占比例计算，得出简单实用的分叶指数：

分叶指数=5叶/4叶X100%正常核分叶指数：

0〜17%

—还见于缺铁性贫血、类风湿性关节炎、遗传性高分叶症（显性遗传）及某些败血症（以左移多见）。

左移—见于感染、败血症、出血、小儿慢性中性粒细胞减少症等。

•中性粒细胞毒性颗粒及空泡改变：

中性粒细胞由于受到外来刺激（包括感染及应激反应）引起颗粒变性，粗大着色深染及浆内空泡等病理性改变。

上述改变及白细胞数增多和出现幼稚及原始细胞则为类白血病反应。

•慢性粒细胞白血病（CML）的中性成熟粒细胞一般胞浆颗粒较正常稀少，但无空泡及毒性颗粒，而慢性中性粒细胞白血病（CNL）的中性成熟粒细胞则与类白血病反应形态相似。

•假性嗜酸性颗粒—在某些干细胞疾病如MDS、粒细胞缺乏症、肾性贫血某些患者中性粒细胞的颗粒增多，形态异常，类似嗜酸性样颗粒的出现。

•遗传性白细胞异常疾病：

是先天性白细胞异常疾病，临床上虽罕见，但为了提高辨别的

能力，应有所认识。

Pelger-Huer白细胞异常：

属于显性遗传，其白细胞形态特点：

核分叶不良，不分叶，核呈花生形、亚铃形等形状，无核丝形成，胞浆正常，此外，还有假性（即继发性）Pelger-huet白细胞异常应加以鉴别，后者常见于急性肠炎、伤寒、疟疾、流感，无家族史，但在原发病得到治疗后白细胞形态恢复正常。

Alder-Reilly颗粒异常：

常染色体隐性遗传性多糖代谢障碍性疾病，常伴有软骨畸形、肝、脾肿大等，中性、嗜酸性及嗜碱性粒细胞含有多量嗜天青颗粒遮盖整个细胞，单核细胞亦有类似改变。

May-Hegglin异常：

为常染色体显性遗传疾病，在中性及嗜酸性粒细胞浆内含有Dunle小体，常伴有巨血小板及血小板减少、紫癜，由于细胞的游走功能差，故病人常出现感染症状。

继发性也可见于猩红热、球菌性感染、烧伤早期等某些病例。

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6外周血细胞形态学检验及技巧

2嗜酸性粒细胞：

此种细胞在人体每日规律性变动，晨至午下降，午后始升，午夜至次晨3时达高峰数值，哮喘患者及夜间工作者其规律与正常相反，晨9至12时达高峰。

临床上嗜酸性粒细胞增多见于：

过敏性疾病，如血管神经性水肿、哮喘、食物及药物过敏、血清病、荨麻疹、枯燥热等。

寄生虫病：

常见于血丝虫、钩虫、包囊虫、肺吸虫、蛔虫、吕弗氏（Lofllers）综合征、蛲虫、旋毛虫、疟疾（偶见）及血吸虫等。

皮肤病：

如湿疹、剥脱性皮炎、天疱疮、牛皮癣、疟疾、疥、感染、猩红热早期等。

血液病：

高嗜酸性粒细胞综合症、CML、嗜酸性粒细胞白血病、何杰金氏病（占10%病例）、嗜酸性肉芽肿、家族性嗜酸性细胞增多症、热带嗜酸性细胞增多症、甲状腺癌及播散性结缔组织病。

与化学药物有关：

镍（致皮肤炎）、青霉素、PAS、苯、呋喃妥因、磺胺等。

3嗜碱性粒细胞：

在正常人血液中为数甚少，该细胞嗜碱性颗粒含大量组织胺及肝素类物质，临床上主要因骨髓增殖性疾病常伴嗜碱性粒细胞增多如CML、CML嗜碱变、嗜碱性粒细胞白血病、M4EO、真性红细胞增多症、骨髓纤维化等。

此外，还可见于感染恢复期、甲状腺功能低下、何杰金病、溶血性贫血、肝硬化、结核病、流感、肿瘤以及月经初潮等.

4淋巴细胞：

淋巴细胞为免疫反应细胞，来源于骨髓淋巴干细胞，经胸腺素作用分化为T淋巴细胞，参与细胞免疫，另一类经骨髓而成为B淋巴细胞，产生免疫球蛋白，可作为体液免疫。

•外周血内淋巴细胞可分为大、中、小淋巴细胞，其形态一般不难辩认，在临床由于各种因素刺激出现异常淋巴细胞，常出现于病毒感染性疾病，如传染性单核细胞增多症、传染性淋巴细胞增多症，传染性肝炎、水痘、风疹、流感、结核病、药物过敏、慢性感染、放射病、应激状态及免疫异常等。

其胞体增大，比正常淋巴大一倍以上，核染色质疏松、增多，胞浆丰富或不规则、有很强嗜碱性呈深兰色、不均匀不透明或有泡沫或深兰色、周边着色加深，可见嗜天青红颗粒或空泡。

按Doney氏类型分三型：

I型：

最多见，胞体增大，核圆、卵圆或肾形，染色质疏松、粗糙，胞浆丰富、深染,有泡沫或空泡，偶有嗜天青颗粒，核/浆约1:

1。

口型：

胞体较大，主要胞浆明显增多，且不规整（体如单核细胞），染色质较致密，不如I型增多聚集，胞浆淡兰染，少数有嗜天青颗粒或少许空泡，核/浆为1:

2。

皿型：

少见，大致与I型相似。

可有核仁。

此外,Tuck细胞即刺激细胞也是一种异常淋巴细胞,其意义