第一章 无菌操作技术实践苏教学案Word文件下载.docx

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3．培养基的种类

划分标准

培养基种类

特点

用途

物理

性质

______

培养基

不加凝固剂

工业生产

加少量凝固剂

观察微生物的运动、

分类、鉴定

加凝固剂，如琼脂

微生物分离、鉴定、

活菌计数、保藏菌种

化学

成分

______培养基

含化学成分不明确的天然物质

培养基成分______（用化学成分已知的化学物质配成）

培养基中加入某种化学物质，以______不需要微生物的生长，________所需要微生物的生长

培养、分离出特定微生物

（如加富培养基中培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素或链霉素；

培养固氮菌可用无氮培养基，如阿须贝培养基）

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种________或____________

________不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落带有绿色金属光泽）

二、消毒与灭菌

1．在微生物培养时获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵

无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括四方面的内容：

（1）对实验操作的________、操作者的________和____进行清洁和消毒。

（2）将用于微生物培养的________、____________和________等器具进行灭菌。

（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在________________进行。

（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

提醒　实验后，所有用过的培养基、培养液等都要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，否则会造成环境污染。

实验过程中一定不可吃东西、喝水。

离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。

2．比较消毒与灭菌

条件

结果

常用方法

消毒

较________的物理或化学方法

仅杀死物体____________对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）

________消毒法（如100℃，5～6min可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢）、________消毒法、____________消毒法

灭菌

______的理化因素

______________________，包括________和________

________灭菌、________灭菌、____________灭菌、________除菌

3.高压蒸汽灭菌

（1）原理：

将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内；

把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭；

再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。

（2）设备：

主要是____________________，实验室中以手提式最为常用。

（3）使用方法

①加水：

使用前在锅内加入适量的水。

②________：

装入待灭菌的物品，不能太满，盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺栓，打开排气阀。

③____________：

加热待水煮沸后，使蒸汽和空气一起从排气孔排出。

④保温保压：

当压力表指针指到121℃时，调节热源，使压力维持不变，并开始计算灭菌时间，根据灭菌的物品确定灭菌时间。

⑤出锅：

当压力表中指针降至________，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物品。

提醒　使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌。

灭菌完成后要等压力表中读数为“0”后，先放气再打开灭菌锅盖。

三、细菌培养基配制的操作流程

1．培养基的配制原则

（1）________________（根据微生物的种类、培养目的等），如生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。

（2）营养要________，注意各种营养物质的浓度和比例。

（3）________要适宜，各种微生物适宜生长的pH范围不同，细菌6.5～7.5、放线菌7.5～8.5、真菌5.0～6.0。

2．配制流程

搁置斜面：

待试管冷却至50℃左右，搁置在合适高度的物体上，使其自然倾斜，斜面不超过试管总长的________

知识点一　培养基的概念、种类

【例1】　下列说法正确的是（　　）

A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质

B．培养基只有两类：

液体培养基和固体培养基

C．除水以外的无机物只能提供无机盐

D．无机氮源不可能提供能量

答案　A

解析　根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；

除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；

无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。

规律链接　

（1）病毒没有独立的生命，依靠活细胞才能生活，普通培养基不能用来培养病毒。

常用于培养病毒的是活鸡胚。

（2）培养基种类繁多，应根据微生物的种类和实验目的，明确培养基的特定用途，选用合适的培养基。

（3）自养微生物和异养微生物的营养区别

微生物营养型

举例

自养型微生物

CO2、NaHCO3

铵盐、硝酸盐等

硝化细菌

异养型微生物

糖类、脂肪酸等

铵盐、硝酸盐、蛋白质等

乳酸细菌

变式训练1　要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（　　）

A．固体培养基

B．液体培养基

C．加青霉素的培养基

D．加入高浓度食盐的培养基

知识点二　消毒与灭菌

【例2】　培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是（　　）

①化学消毒　②灼烧灭菌　③干热灭菌　④紫外线消毒　⑤高压蒸汽灭菌　⑥巴氏消毒法

A．⑤③②①④⑥B．①②③④⑤⑥

C．⑥②③④①⑤D．③④②①⑥⑤

解析　培养基用高压蒸汽灭菌；

培养皿能耐高温，需用干热灭菌；

接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；

实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；

空气可用紫外线消毒；

牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。

规律链接　常见的消毒方法：

（1）日常生活经常用到的是煮沸消毒法；

（2）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；

（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；

（4）实验操作者的双手使用酒精进行消毒；

（5）饮水水源用氯气进行消毒。

变式训练2　下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（　　）

A．防止杂菌污染

B．消灭杂菌

C．培养基和发酵设备都必须灭菌

D．灭菌必须在接种前

知识点三　培养基的配制

【例3】　下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是（　　）

A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯

C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板

D．待平板冷却凝固约5～10min后将平板倒过来放置

解析　制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。

牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，再用玻棒取出称量纸。

待培养基冷却至50℃左右时，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时倒平板。

平板冷却凝固约5～10min后还需倒置。

规律链接　

（1）不同微生物对营养需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。

（2）营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。

例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为4∶1时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；

当碳源与氮源的比为3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大增。

变式训练3　若在牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，对这一说法不正确的是（　　）

A．不被所培养的微生物分解利用，对所培养的微生物无毒害作用

B．在微生物生长温度范围内保持固体状态

C．琼脂凝固点温度低，利于微生物的生长

D．凝固剂在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强

一、选择题

1．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。

下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物的营养的描述中，不正确的是（　　）

A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素

B．碳源物质也是该微生物的能源物质

C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质

D．水是该微生物的营养要素之一

2．若大肠杆菌和圆褐固氮菌混合在一起采用下列哪组培养基可将它们分离（　　）

A．加食盐的培养基和蛋白胨培养基

B．伊红—美蓝培养基和无氮培养基

C．斜面培养基和液体培养基

D．加青霉素的培养基和液体培养基

3．下表为牛肉膏蛋白胨培养基的成分列表，据此回答：

牛肉膏

蛋白胨

NaCl

H2O

含量

0.5g

1g

100mL

其中的牛肉膏和蛋白胨能够提供（　　）

A．碳源B．氮源

C．能源D．包括A、B、C三项

4．下表是关于四种生物能源、碳源、氮源、新陈代谢类型的描述。

描述正确的一组生物是（　　）

乳酸菌

根瘤菌

衣藻

能源

氧气、NH3

分解

乳液

固定N2

利用

光能

CO2

糖类

NH3

N2

NO

代谢

类型

自养需

氧型

异养厌

异养需

A.硝化细菌与乳酸菌B．乳酸菌与根瘤菌

C．根瘤菌与衣藻D．硝化细菌与衣藻

5．实验室用于分离出与大肠杆菌混杂的酵母菌，培养基的要求是（多选）（　　）

A．添加琼脂B．不加氮源

C．添加青霉素D．pH调节到7.0～8.0

6．下列培养基配方中，能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（　　）

原料

①

②

③

④

10g

乳糖

5g

蔗糖

KH2PO4

2g

伊红

0.4g

美蓝

0.065g

琼脂

20g

蒸馏水

1000mL

A.①③B．②①C．②④D．③①

7．下列关于无菌操作的叙述，错误的是（　　）

A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌

B．将用于微生物培养的培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌

C．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行

D．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触

二、简答题

8．为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制的培养基的配方如下：

蛋白胨10g；

乳糖5g；

蔗糖5g；

K2HPO42g；

伊红Y0.4g；

美蓝0.065g；

蒸馏水1000mL；

将培养基pH调至7.2。

（1）该培养基所含的碳源有____________________，其功能是______________________。

（2）该培养基所含的氮源有__________，其功能是________________________________。

（3）该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是________________________。

（4）该细菌在同化作用上的代谢类型是__________。

（5）该培养基可用来鉴别哪种细菌________。

A．霉菌B．大肠杆菌

C．酵母菌D．乳酸菌

9．某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。

首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。

请回答下列问题：

（1）对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：

________、________、________、________、________。

其中提供氮源的是________________；

提供能源的主要物质是________。

（2）微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的________。

在烧杯中加入琼脂后要不停地________，防止______________________________。

（3）将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入__________________中灭菌，压力________kPa，温度________，时间_________。

灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。

如果棉塞上沾有培养基，此试管应____________。

（4）使用高压蒸汽灭菌锅时应注意，先向锅内倒入________，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后再将锅密闭。

知识清单

一、1.人工培养　生长　繁殖　代谢产物　2.碳源　氮源　无机物　水　碳　氮　3.液体　半固体　固体天然　合成　明确　分类、鉴定　选择　抑制　促进　鉴别　指示剂　化学药品　鉴别

二、1.

（1）空间　衣着　手　

（2）器皿　接种用具　培养基　（3）酒精灯火焰附近　2.温和　表面或内部一部分　煮沸　巴氏　化学药剂　强烈　杀死物体内外所有微生物　芽孢　孢子　灼烧　干热　高压蒸汽　过滤　3.

（2）高压蒸汽灭菌锅　（3）②装锅③加热排气　⑤“0”点

三、1.

（1）目的要明确　

（2）协调　（3）pH　2.称量　溶化　调节pH　分装　包扎　灭菌　放待灭菌物品加盖密封　高压灭菌　1/2

变式训练

1．A　[固体培养基主要用于微生物的分离、鉴定等。

液体培养基用于工业生产。

加入青霉素的选择培养基能抑制细菌、放线菌的生长，从而分离酵母菌和霉菌。

加入高浓度食盐的培养基可抑制多种细菌的生长，可分离金黄色葡萄球菌。

本题没说明分离哪种细菌，故应用固体培养基。

]

2．B　[灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。

A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；

B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。

C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌。

发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。

3．C　[理想的凝固剂应具备以下条件：

不被所培养的微生物分解利用，在微生物生长的温度范围内保持固体状态，凝固剂的凝固点不能太低，否则不利于微生物的生长，如琼脂凝固点为40℃，对所培养的微生物无毒害作用，并且在灭菌时不会被破坏，透明度好，凝固力强，配制方便，价格低廉。

常用凝固剂有琼脂、明胶。

达标测试

1．B　[CO2可为自养型微生物提供碳源，但不能提供能源。

2．B　[大肠杆菌的代谢产物可与伊红和美蓝结合，使菌落带有绿色金属光泽；

圆褐固氮菌能自行固氮，可用无氮培养基选择。

3．D　[牛肉膏为瘦牛肉浸出汁浓缩而成的膏状物质，富含水溶性糖类、有机氮化合物、维生素、盐等。

蛋白胨是将肉酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成，富含有机氮化合物，也含一些维生素和糖类。

4．D　[乳酸菌不能直接利用N2，且能量来源为糖类。

根瘤菌为异养型生物，进行生命活动所需要的能量来自糖类等有机物的分解。

5．AC　[分离微生物应用固体培养基，应加琼脂；

大肠杆菌对青霉素敏感而酵母菌不敏感，加入青霉素可抑制大肠杆菌生长繁殖。

酵母菌对pH的要求是5.0～6.0，需要氮源。

6．D　[高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。

在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。

7．A　[对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒而不是灭菌。

8．

（1）乳糖、蔗糖、蛋白胨　主要构成微生物的细胞物质和代谢产物　

（2）蛋白胨　主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物　（3）水、无机盐　（4）异养型（5）B

解析　对于异养型微生物来说，含C、H、O、N的物质，既是碳源，也是氮源。

各类微生物的最适pH不同，酵母菌、霉菌适宜在偏酸（pH为4.5～6.0）环境中生长。

伊红—美蓝是鉴别大肠杆菌的物质。

9．

（1）牛肉膏　蛋白胨　水　无机盐　琼脂　蛋白胨、牛肉膏　牛肉膏　

（2）比例　搅拌　琼脂糊底引起烧杯破裂　（3）高压蒸汽灭菌锅　100　121℃　15～30min　废弃　（4）适量水

解析　本题主要考查对食用菌菌种扩大培养并保存的过程中涉及到的培养基配制、灭菌的一些基础知识。

第2课时　微生物的培养和应用（Ⅱ）

【目标导航】　1.尝试进行微生物的分离和培养的无菌操作技术。

2.掌握常用的接种技术。

3.掌握微生物学的分离纯化方法。

【重点提醒】　1.无菌操作与接种技术。

2.微生物的分离纯化方法。

一、无菌操作和接种技术

1．接种

（1）概念：

在________条件下将________接入______的操作过程。

（2）工具：

________、接种针和____________。

（3）方法：

________接种、____________接种和____________接种。

2．无菌操作

是微生物____________的关键。

（1）培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在________之前都需要________。

（2）通常接种操作要在________的附近进行。

3．接种操作程序

（1）用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，并使斜面向上成______状态。

________拧松棉塞，但不要取下。

（2）________拿接种环（如握钢笔），在火焰上____________。

注意：

有可能伸入试管内的接种环其余部分也要灼烧，特别是箍处。

（3）在火焰边用右手无名指和小指夹住两个小棉塞，将它们取下（不能放下）。

同时左腕转动，烧灼______一周，勿烧得过烫。

（4）将接种环伸入试管内，让环部先接触培养基上未长菌的部位使其________。

然后，轻轻挑取____________，立即将接种环抽出。

（5）在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部，由底部向上轻轻划________曲线，线要划密一些。

注意划曲线时不要将培养基________，也不要使接种环接触到管壁或管口。

划线时不要______，线条要________并且________，划线的方向应从________向________。

（6）抽出接种环，再用火焰____________，并在____________将棉塞塞上。

将接种环在________上烧红灭菌，接种致病菌时更要注意这点。

将棉塞旋紧。

（7）将接种过菌种的试管放在________中，（在37℃）培养24h，观察培养的结果。

4．大肠杆菌的相关知识：

大肠杆菌是进行微生物学、分子遗传学和基因工程研究的好材料。

大肠杆菌存在于动物和人肠道内，是肠道内的共生菌。

在正常情况下，大肠杆菌可以合成维生素B和维生素K，供机体吸收利用；

一些菌株还能产生大肠杆菌素，抑制肠道的致病菌和腐生菌的滋生，对机体有利。

但是，当机体衰弱或受到外伤时，大肠杆菌易侵入肠外组织或器官，就会成为条件致病菌，可引起肠外感染。

因此，卫生学上常以“大肠菌群数”和“细菌总数”作为饮用水、牛奶、食品、材料等的卫生鉴定指标。

二、微生物常用的分离与纯化方法

1．原理：

根据微生物对________、________、________等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的________条件，或加入某些________使非目的微生物不能生长，从而达到____________微生物的目的。

2．初步分离方法

据菌落特征初步分离

（1）菌落：

________微生物在适宜的________培养基________或________生长、繁殖到一定程度，可以形成________________、有一定____________的子细胞____________。

（2）菌落特征：

________微生物在________培养基上生长形成的________或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该类微生物进行________、________的重要依据。

3．微生物的分离和纯化最常用的方法——________________。

平板分离法最常用的方法包括涂抹平板法、混合平板法和平板划线法，所用培养基为琼脂固体培养基平板。

（1）涂抹平板法

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

①____________操作

a．取盛有9mL水的无菌试管6支，编号为101、102、103、104、105、106。

b．用移液管吸取________培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。

用手指轻压移液管上的橡皮头，并吹吸3次，使菌液与水充分混匀。

c．从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102试管内吹吸均匀，获得102倍液，依此