1 第18讲 微生物的利用和生物技术在食品加工中的应用Word格式文档下载.docx

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一定时间内，菌落周围出现红色区域。

用浓度为10－4和10－5土壤稀释液接种，更容易形成单菌落的是10－5土壤稀释液。

3．构建微生物的培养与应用网络

4．有关微生物实验的基本方法

（1）制备培养基：

计算→称量→融化→灭菌→倒平板。

（2）无菌技术：

主要指消毒和灭菌。

（3）倒平板操作：

待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

（4）划线分离操作：

划线分离是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

（5）涂布分离法：

先将菌液进行一系列梯度稀释后，分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。

如图：

　（2018·

浙江11月选考）回答与微生物培养及应用有关的问题：

（1）对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从____________________时开始计时。

对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用________方式可较快地进行过滤灭菌。

（2）与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加__________________的过程。

某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是________________________________________________________________________。

（3）为筛选胞外α淀粉酶分泌型菌种，一般从__________（A.果园树下　B．肉类加工厂周围　C．米酒厂周围　D．枯树周围）获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。

若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个________________________比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。

然后将培养液离心，取________用于检测酶活性。

[答案]　

（1）达到设定的温度和压力值　抽滤

（2）将淀粉分解成小分子糖　作为碳源

（3）C　水解圈直径与菌落直径　上清液

微生物纯化培养的方法

（1）划线分离法

（2）涂布分离法：

先将菌液进行一系列梯度稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。

如图所示：

[题组突破]

1．（2019·

高考江苏卷）下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（　　）

A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌

B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧

C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染

D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基

解析：

选A。

培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误。

接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后灼烧可以防止微生物扩散，对人造成危害，B正确。

接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确。

在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数可以使用固体培养基，D正确。

2．牛奶是微生物生长的良好培养基。

生鲜牛奶中的微生物情况反映了奶牛的健康状况，也影响奶制品的运输和贮藏。

牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。

为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。

用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。

请回答下列有关问题：

（1）巴氏消毒的方法是______________________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是____________。

（2）取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图中的________。

（3）图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。

若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值________（填“偏大”或“偏小”），原因是______________________________________________________________。

（4）消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？

____________________________________________。

（5）从生牛奶取样培养得到的菌落中，混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入________，菌落具有____________________特征的可以认定为大肠杆菌。

（1）采用巴氏消毒法消毒牛奶，即在70～75℃煮30分钟或80℃煮15分钟，在杀灭牛奶中有害菌群的同时牛奶的营养成分不被破坏。

（2）取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择涂布器，即图中的B。

（3）依题意并结合图示可推测每毫升含细菌数为[（35＋33＋34）÷

3]×

104÷

0.1＝3.4×

106个。

在统计菌落时，当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。

（4）消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用涂布分离法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应减少稀释次数。

（5）欲检测大肠杆菌，可在培养基中加入伊红美蓝，大肠杆菌菌落会呈黑色，略带金属光泽。

答案：

（1）70～75℃煮30分钟（80℃煮15分钟）　牛奶的营养成分不被破坏　

（2）B　（3）3.4×

106　偏小　个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的　（4）稀释次数减少　（5）伊红美蓝　（金属光泽的紫）黑色

3．（高考全国卷Ⅰ改编）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。

回答下列问题：

（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生______________________。

能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是______________________

________________________________________________________________________。

但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________________________

（答出两点即可）。

（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是__________________________

______________________________________________。

（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________________

（1）土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。

尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物（如葡萄糖）

作为碳源；

葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。

（2）选择培养基是只允许特定种类的微生物（目的微生物）生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此，配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。

（3）KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO

/HPO

可以使培养基中pH保持相对稳定。

（1）脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

（2）尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

　生物技术在食品加工中的应用

1．果酒的制作

（1）原理：

酵母菌在无氧条件下将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇浓度超过16%时，酵母菌就会死亡。

（2）反应式：

C6H12O6―→2C2H5OH＋2CO2。

2．果醋的制作

醋杆菌在有氧条件下将乙醇氧化成醋酸。

C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。

若缺少糖源时，醋杆菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。

3．泡菜的腌制

（1）作用菌类：

假丝酵母和乳酸菌。

（2）原料：

白菜、洋白菜等。

（3）原理：

在无氧的条件下，微生物利用蔬菜中的糖和其他营养物质进行发酵，假丝酵母发酵产生醇类，乳酸菌将糖转化为乳酸，这时杂菌被杀死。

加白酒的作用是可抑制杂菌生长，也是一种调味剂，增加醇香感。

4．亚硝酸盐的测定

（1）危害：

致癌。

（2）测定：

亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N1萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。

5．泡菜制作过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化情况分析

　项目

时期　　

乳酸菌

乳酸

亚硝酸盐

发酵初期

少（有氧气，乳酸菌活动受到抑制）

少

增加（硝酸盐还原菌作用）

发酵中期

最多（乳酸抑制其他菌活动）

积累增多，pH下降

下降（硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解）

发酵后期

减少（乳酸积累，pH下降，抑制其活动）

继续增多，pH继续下降

下降至相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制）

6.果酒、果醋、泡菜制作的比较

比较

项目

果酒的制作

果醋的制作

泡菜的制作

作用

菌种

酵母菌（真菌）

醋杆菌（细菌）

假丝酵母（真

菌）和乳酸

菌（细菌）

原理

酵母菌在无氧的条件下将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇浓度为16%时，酵母菌死亡

醋杆菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸

乳酸菌和假丝酵母在无氧条件下将糖转化为乳酸和醇类物质

制作

流程

↓

续　表

注意

事项

①果酒制作过程中，紫葡萄在用高锰酸钾溶液浸泡后，一定要用清水将高锰酸钾溶液冲洗干净；

②将葡萄浆放入发酵瓶时，装量不能超过2/3

①果醋发酵时，通气孔需塞上脱脂棉球，以过滤空气；

②醋化醋杆菌培养物与酒—水混合物混匀后需将pH调至7.0

制作泡菜时，用水密封坛口，以保证坛内无氧环境，利于乳酸菌和假丝酵母发酵

7.亚硝酸盐的测定方法

（1）样品处理：

泡菜匀浆过滤后调pH至8.0→加硫酸锌溶液25mL→加氢氧化钠溶液至产生白色沉淀→水浴加热至60℃→过滤取滤液定容。

10mL样品溶液＋4.5mL氯化铵缓冲液＋2.5mL60%乙酸溶液＋5mL显色液→定容→暗处静置25min→550nm处测定光密度值（10mL水为空白对照）。

（3）标准曲线的绘制：

以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）计算

公式：

X1＝（m2×

V1）/（m1×

V2）

X1：

样品中亚硝酸盐含量，单位mg/kg；

m1：

样品质量，单位g；

m2：

通过标准曲线得到的亚硝酸盐质量，单位μg；

V1：

样品处理液总体积；

V2：

测定用样品液体积。

　苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的，回答下列问题：

（1）酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。

图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的__________________中进行，其产物乙醇与__________________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；

过程③在酵母菌细胞的________________中进行。

与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度________________。

（2）第二阶段是在醋杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在________________条件下才能完成。

（3）在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度________________（填“低于”或“高于”）第二阶段的。

（4）醋杆菌属于________核生物，其细胞结构中________（填“含有”或“不含有”）线粒体。

[解析]　

（1）酵母菌需氧呼吸第一阶段及厌氧呼吸全过程在细胞溶胶中进行；

酒精与重铬酸钾试剂反应呈灰绿色。

图示过程③为细胞需氧呼吸第二、三阶段，在线粒体中进行。

与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度快。

（2）醋杆菌的呼吸作用类型为需氧呼吸，所以将乙醇转变为醋酸的过程需在有氧条件下进行。

（3）酒精发酵时一般将温度控制在18～25℃，醋酸发酵时一般将温度控制在30～35℃，故在生产过程中，酒精发酵温度低于醋酸发酵温度。

（4）醋杆菌属于原核生物，其细胞结构中不含线粒体。

[答案]　

（1）细胞溶胶　重铬酸钾　线粒体　快

（2）有氧　（3）低于　（4）原　不含有

（1）传统发酵食品的发酵类型

①果酒制作和泡菜制作：

无氧发酵，应控制无氧条件。

②果醋制作：

有氧发酵。

（2）发酵菌种类型

①果酒制作的发酵菌种：

真菌。

②果醋制作和泡菜制作的发酵菌种：

细菌。

（3）果酒和果醋发酵装置的设计思路

①酵母菌繁殖需要氧气，醋杆菌是好氧细菌，则果酒制作前期和果醋制作整个过程都需要氧气；

酵母菌产生酒精时是厌氧的，则在充气口处应该设置开关。

②发酵过程中产生CO2，需要设置排气口；

为了防止空气中微生物污染，排气口应该连接一个长而弯曲的胶管。

③为便于取样及监测发酵情况，需要设置出料口。

1．下图为某同学设计的酿制苹果醋的基本流程图和发酵装置示意图。

下列相关分析正确的是（　　）

A．①过程要先切块后清洗，以减少杂菌的污染

B．②过程加入果胶酶可以提高苹果的出汁率

C．③过程发酵所用酵母菌无具膜结构的细胞器

D．④过程需要将发酵装置中的充气口开关关闭

选B。

①过程要先清洗后切块，以减少杂菌的污染，A项错误；

植物细胞有细胞壁的保护，破坏细胞壁需要纤维素酶和果胶酶，B项正确；

酵母菌是真核生物，含有具膜细胞器，如线粒体等，C项错误；

醋化醋杆菌是好氧菌，因此发酵装置中的充气口开关应开启，D项错误。

2．（2017·

浙江4月选考）回答与泡菜腌制和亚硝酸盐测定有关的问题：

（1）制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。

取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用________蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。

下图所示的划线分离操作，正确的是________。

（2）泡菜腌制过程中，会产生有机酸、醇类和亚硝酸盐，其中醇类是由________进行厌氧呼吸产生。

亚硝酸盐对人体有害，为测定泡菜中亚硝酸盐含量，从泡菜中提取亚硝酸盐，与________发生重氮化反应，再与N1萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物。

然后用光程为1cm的__________，

在550nm光波下测定光密度值，与由一直浓度梯度亚硝酸钠制作的________比对，计算样品中亚硝酸盐的含量。

（3）已知乳酸菌中的亚硝酸还原酶能降解亚硝酸盐。

在一定的腌制时间内，随着腌制时间的延长，泡菜中亚硝酸盐含量逐渐降低，是由于在厌氧和________环境下亚硝酸盐被亚硝酸还原酶降解。

（1）接种环　B　

（2）假丝酵母　对氨基苯磺酸

比色杯　标准曲线　（3）酸性

课后作业

一、选择题

1．下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是（　　）

A．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行

B．步骤①中，待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖

C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灼烧处理

D．划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养

由图可知，步骤①是倒平板，步骤②是用接种环蘸取菌液，步骤③是进行平板划线，步骤④是培养。

①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A项正确；

倒完平板后应立即盖上培养皿的皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B项错误；

每次划线前后灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C项正确；

划线接种结束后，将平板倒置放入培养箱中培养，有利于培养基表面的水分更好地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D项正确。

2（2019·

高考北京卷）筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。

接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。

菌落直径：

C（mm）

透明圈直径：

H（mm）

H/C

细菌Ⅰ

5.1

11.2

2.2

细菌Ⅱ

8.1

13.0

1.6

有关本实验的叙述，错误的是（　　）

A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质

B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布

C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外

D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异

选C。

微生物培养基含有四类营养物质：

水、无机盐、碳源、氮源，A项正确；

常用稀释涂布平板法筛选淀粉分解菌，涂布前需将菌液稀释，B项正确；

由题图可知，细菌Ⅰ和Ⅱ形成的菌落周围都出现了透明圈，说明两种细菌都能将淀粉酶分泌至细胞外，C项错误；

淀粉分解菌可分解淀粉，导致菌落周围的淀粉被分解，不能与碘液反应生成蓝色，故而出现透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明细菌分解淀粉的能力越强，D项正确。

3.

某同学设计了右图所示的发酵装置来制作果酒、果醋，下列有关叙述错误的是（　　）

A．甲用来制作果酒，乙用来制作果醋

B．乙装置需要的温度条件高于甲

C．该装置便于发酵中产生气体的排出

D．甲、乙装置中排液管排出液体的pH都下降

甲装置密闭，可用来进行酵母菌的发酵制作果酒，酒精进入乙装置中，在有氧条件下，可用来制作果醋，A项正确。

酵母菌的发酵温度一般为25～30℃，而醋化醋杆菌的最适生长温度为30～35℃，B项正确。

甲到乙、乙到丙流入的都是发酵液，甲装置中没有气体的排出口，该装置不便于发酵中产生气体的排出，C项错误。

甲装置中产生酒精和CO2，导致排出液体的pH下降；

乙装置将乙醇转变为醋酸，导致排出液体的pH也下降，D项正确。

二、非选择题

4．下图是以鲜苹果汁为原料，利用发酵瓶制作果酒和果醋的过程简图，分析并回答下列问题：

（1）在果汁加工过程中可添加__________________酶提高出汁率和澄清度。

（2）在鲜苹果汁装入发酵瓶时，要留有大约________的空间。

经过10～12天后，在酸性条件下用重铬酸钾检测样液，如果颜色由________色变为________色，说明产生了酒精。

（3）过程乙中使用的微生物是________，可以从食醋中分离纯化获得。

纯化菌种时需要对培养基进行灭菌，其方法是____________________；

培养温度控制在________℃范围内。

（4）在________的条件下，如果缺少糖源，乙中的微生物将甲过程的产物变为乙醛，再将其变为醋酸。

（1）纤维素酶和果胶　

（2）1/3　橙　灰绿

（3）醋杆菌　高压蒸汽灭菌法　30～35

（4）氧气充足（有氧）

5．图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

（1）图中选择培养基应以________为唯一氮源；

鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。

（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。

该过程采取的接种方法是____________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×

108个；

与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。

突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白质含________个氨基酸。

（1）筛选产脲酶细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源；

鉴别培养基还需要添加酚红作指示剂，产脲酶细菌产生的脲酶可以将尿素分解成氨，导致培养基的pH升高，菌落周围的指示剂将变成红色。

（2）图中过程采取的接种方法是涂布分离法，每克土壤样品中的细菌数量为：

（156＋178＋191）/3÷

0.1×

105＝1.75×

108，血细胞计数板计数法所得数据包括死的细菌，且涂布分离法计数时所计菌落数少于真正的活细菌数，故与血细胞计数板计数法相比，此计数法测得的细菌数较少。

（3）图乙从起始密码算起的碱基序列号为271，前270个碱基决定90个氨基酸，从271位到箭头处可以决定1个氨基酸，然后插入70个核苷酸，可决定23个氨基酸，多出一个碱基，加上后面的AG刚好可以决定1个氨基酸，则后面UGA是终止密码。

因此突变基因转录的mRNA终止密码为UGA，突变基因表达的蛋白质所含氨基酸数为90＋1＋23＋1＝115（个）