肝糖原的提取鉴定与定量-第七实验室Word文档下载推荐.docx

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一、实验目的

1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；

2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法；

3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式；

4、正确掌握使用离心机的方法步骤；

5、熟练运用溶液混匀的各种方法；

6、正确掌握溶液转移的操作；

7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤

二、实验原理

实验1肝糖原的提取与鉴定

糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。

肝细胞破碎，细胞内容物流出。

低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。

糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。

这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。

此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。

糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。

CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu（OH）2↓

2Cu（OH）2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O

2CuOH=H20+Cu2O↓（红色）

Cu（OH）2====H2O+CuO↓（黑色）

实验2肝糖原定量测定

糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。

糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。

该物质在620nm处有最大吸收。

糖含量在10-100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。

利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。

三、材料与方法：

以流程图示意

1、实验材料

（1）肝糖原的提取与鉴定

样品：

1.50g的鸡肝

试剂：

5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂

仪器和器材：

离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温-100℃恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板

（2）肝糖原的定量测定

0.15g的鸡肝

30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液显色剂

室温-100℃恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪

3、实验步骤与方法

（1）肝糖原的提取与鉴定：

鸡肝约1.5g,剪碎

+1ml5%三氯醋酸，研磨至乳状

+3ml5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心5min（4000r/min）

上清液（取2ml）

沉淀（弃去）

加碘试剂2滴

糖原溶液2滴

糖原水解液

糖原水解液2滴

呈色对比

+班氏试剂4滴

+浓HCl5滴

沸水浴15min,冷却

+50%NaOH5滴

+2ml95%乙醇，混匀，静置10min

离心5min（4000r/min）

沉淀

上清液（弃去）

沸水浴2min,溶解沉淀

糖原溶液1ml

白瓷板孔穴中

混匀

蒸馏水2滴

沸水浴2min,观察变化

图一：

肝糖原的提取与鉴定实验流程

（2）肝糖原定量测定

冷却，全部转入100ml容量瓶中

沸水浴15分钟

鸡肝0.15g，

加30%KOH1.5ml

糖原的测定

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

图二：

肝糖原定量测定试验流程

取3支试管，按下表操作。

试剂（ml）

空白管

标准管

样品管

蒸馏水

1.0

—

标准葡萄糖溶液

糖原提取液

0.2%蒽酮溶液

2.5

表一：

糖原测定试管操作

混匀，沸水浴10分钟，冷却至室温。

在分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。

四、结果与讨论：

①结果：

实验数据、现象、图谱；

②讨论：

以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

1、实验现象

实验一：

肝糖原的提取与鉴定

①所获糖原溶液如下图：

图三：

所获糖原溶液

所获糖原溶液呈乳样光泽。

②将糖原溶液滴到碘试剂中可以勉强看到溶液出现浑浊，砖红色沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少。

碘液+蒸馏水

碘液+糖原溶液

图四：

糖原溶液与碘试剂反应

③糖原水解液与班氏试剂混合后溶液变深蓝。

沸水浴加热2min后，产生浑浊，砖红色沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少。

沸水浴后

沸水浴前

图五：

糖原水解液与班氏试剂混合沸水浴后

实验二：

肝糖原的定量测定

空白管、标准管和样品管混匀呈现如下颜色反应

图六：

加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比

2、吸光度数据记录：

620nm波长吸收度值记录

测定次数

各管吸光度值A620

1

0.672

0.099

2

0.671

0.101

3

0.102

各管平均值

表二：

620nm波长吸收度值记录表

3、结果计算：

根据公式：

肝糖原（g/100g肝组织）=

计算结果得样品肝糖原（g/100g肝组织）=0.56g/100g肝组织

故本次实验结论为：

该鸡肝样品含有肝糖原，且肝糖原含量为0.56g/100g肝组织。

4、结果分析

经查阅资料得：

饱食鸡肝的肝糖原含量为：

2～3g/100g肝组织，而本次实验测得肝糖原=0.56g/100g肝组织，即本次实验测得的肝糖原含量偏低。

5、讨论总结

（1）与碘试剂反应时：

加入糖原的孔穴并没有出现预期的明显红棕色。

究其原因，在取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少。

而又因为碘试剂本身是黄色的，本来现象就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。

（2）糖原中葡萄糖的鉴定：

实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。

原因还是糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到明显的砖红色。

（3）在肝糖原定量测定中，三只试管水浴15min后，标准管颜色最为明显，为绿色，加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。

（4）由资料可知饱食鸡肝糖原含量宜在2～3g/100g肝组织，而本次实验测得肝糖原为0.56g/100g肝组织，偏低。

究其原因，实验中操作没有失误，与其他小组和其他实验室对比，发现各小组结果均偏低，可以推测，实验现象不明显原因是鸡肝材料糖原含量偏低。

6、结论：

本次试验为《肝糖原的提取、鉴定与定量》，通过这次实验掌握了组织样品的制备方法，了解了其注意事项；

了解了肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握了其操作方法。

巩固了正确操作使用刻度吸管和移液枪。

掌握了溶液转移的操操作，复习巩固了正确操作分光光度计。

实验中没有错误与过失，结果正常。

呈色反应、颜色观察与定量测定都正确成功。