细胞迁移侵袭实验操作步骤TranswellWord文档格式.doc

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2.2制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×

105/ml。

2.3接种细胞

①取细胞悬液100µ

l加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µ

l含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：

常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。

24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.4结果统计

直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。

取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。

0.1%结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。

400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

实验材料

（1）Transwellchamber:

24-well,8.0-μmporemembranes（Corning）

（2）细胞培养相关试剂：

无血清培养基，10％血清培养基，PBS，0.02％EDTA

（3）固定液：

甲醇

（4）染色液：

Giemsa染液

（5）封片剂：

中性树胶

（6）其他：

小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片

操作步骤

（1）所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37℃温育；

（2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×

105/ml；

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl含10％血清的培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；

（4）用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟；

（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μlGiemsa染液的孔中，室温染色15－30分钟；

（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

（7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；

（8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。

注意事项

（1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。

常用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径；

（2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。

常规24-wellchamber接种细胞数约为2≈5×

104/well，迁移时间12≈36小时；

（3）由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）；

（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/mlFN（Fibronectin），具体可查阅相关文献；

（5）细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；

（6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。

但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。

尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；

（7）Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；

（8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。

细胞侵袭实验（cellinvasionassay）

（1）Matrigel（BD5mg/ml），-20℃保存

（2）其余材料同迁移实验

（1）Matrigel在4℃过夜融化；

（2）用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；

（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel，37℃温育4－5小时使其干成胶状；

（4）后续步骤同迁移实验（1-8）。

（1）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；

（2）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；

（3）其他注意事项同迁移试验。

其他

Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤

（1）基质胶准备：

将冻存于－80度冰箱的BDmatrigel4度过夜（24h），变成液态；

（2）取300ul无血清培养基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel，混匀，（4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3个室）；

放入37℃培养箱中，孵育4-5h（>

5h）；

此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。

注释：

无血清培养基和基质胶按1：

5稀释，每孔加50ul，在37℃培养箱中1-2h。

（3）消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；

（4）用无血清培养基洗Matrigel洗1次；

每孔加入100ul细胞悬液；

（5）下腔室中加入500ul含有20％FBS条件培养基；

（6）37℃培养箱中，孵育20-24h；

（7）取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；

（8）加入结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min），室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

迁移实验

transwell在24孔板中浸泡1小时；

消化细胞，无血清培养基洗2次，计数，配成细胞悬液，每孔加入100ul细胞悬液；

加药刺激；

下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子；

37℃培养箱中，孵育20-24h；

取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；

PBS洗2遍，加入结晶紫（0.1%）染色，室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数10照相，记录。

侵袭实验

取300ul无血清培养基，加入30ul（或50ug/每室）Matrigel，混匀，（4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3个室）；

放入37℃培养箱中，孵育4-5h（>

5h）；

消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；

用无血清培养基洗Matrigel洗1次；

每孔加入100ul细胞悬液；

下腔室中加入600ul无血清条件培养基；

37℃培养箱中，孵育20-24h；

取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；

PBS洗2遍，加入结晶紫（0.1%）染色，室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察

transwell小室是否可以重复利用，该怎样消毒

用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×

5min，蒸馏水3×

5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×

2，效果很好。