赤芝子实体化学成分研究.docx

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赤芝子实体化学成分研究

赤芝子实体化学成分研究

摘要:

目的:

研究赤芝Ganodermalucidum子实体的化学成分。

方法:

利用硅胶、SephadexLH-20凝胶、MCI和ODS等柱色谱方法进行分离、纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据分析鉴定其结构。

结果:

从赤芝子实体70%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位分离得到11个化合物,分别鉴定为7个三萜类化合物:

赤芝酸C

（Ⅰ）、4,4,14α-trimethyl-3-oxo-5α-pregna-7,9（11）-diene-20S-carboxylate（Ⅱ）、3β,7α-二羟基羊毛甾-8,23-二烯-11-酮（Ⅲ）、3β,7β,15β-三羟基-11,23-二羰基羊毛甾-8,16-二烯-26-烷酸甲酯（Ⅳ）、甲基灵芝酸C2（Ⅴ）、3,7,15,22-四羟基羊毛甾-11-酮

（Ⅵ）、赤芝酮F（Ⅶ）;3个甾体类化合物:

豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇（Ⅷ）、麦角甾醇（Ⅸ）、麦角甾-7,22-二烯-3-酮（Ⅹ）;1个脑苷类化合物:

1-O-β-D-glucopyr-anosy-l-（2S,3R,4E,8Z）-2-N-（2R）-hydroxytetracosanoyl-octadecasphinga-4,8-dienine（Ⅺ）。

结论:

化合物Ⅲ、Ⅳ为首次从赤芝子实体中分离得到,化合物Ⅷ、Ⅺ为首次从灵芝属中分离得到。

关键词：

赤芝子实体;三萜;甾体;脑苷;化学成分

赤芝Ganodermalucidum（Leyss.exFr.）Karst.为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌的干燥子实体[1],始载于《神农本草经》,列为上品,具有补中益气、滋外强壮、扶正固本、延年益寿等功效,在中国主要分布在海南、云南、福建等地。

临床上主要用于治疗心悸失眠、心神不宁、神疲乏力、肺虚咳喘、虚劳短气等疾病[2]。

近年来,国内外学者对灵芝的生物活性和化学成分进行了广泛研究,证明灵芝水提物的主要成分为灵芝多糖,有增强免疫和抗肿瘤作用[3,4],从赤芝醇提物中分离到多种三萜类化合物,体外实验表明,部分三萜类化合物有抗肿瘤、抗炎、肝保护等作用[5-7]。

为从赤芝醇提取中分离出更多活性成分,本实验对赤芝子实体70%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行了研究,从中分离得到11个化合物,分别鉴定为7个三萜类:

赤芝酸C（lucidenicacidC,Ⅰ）、4,4,14α-trimethyl-3-oxo-

5α-pregna-7,9（11）-diene-20s-carboxylate（Ⅱ）、3,7二羟基羊毛甾-8,23-二烯-11-酮（（3β,7α）-3,7-dihydroxylanosta-8,24-dien-11-one,Ⅲ）、3β,7β,15β-三羟基-11,23-二羰基羊毛甾-8,16-二烯-26-烷酸甲酯（3β,7β,15β-trihydroxy-11,23-dioxo-lanost-8,16-

dien-26-oicacidmethylester,Ⅳ）、甲基灵芝酸C2（methylganoderateC2,Ⅴ）、3,7,15,22-四羟基羊毛甾-11-酮（ganosineniolA,Ⅵ）、赤芝酮（lucidoneF,Ⅶ）;三个甾体类:

豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇（stigmasta-7,22-diene-3β,5α,6α-triol,Ⅷ）、麦角甾醇（ergosterol,Ⅸ）、麦角甾-7,22-二烯-3-酮（ergosta-7,22-diene-3-one,Ⅹ）;1个脑苷类:

1-O-β-D-glucopyranosyl-（2S,3R,4E,8Z）-2-N-（2R）-

hydroxytetracosanoyl-octadecasphinga-4,8-dienine（Ⅺ）,其中化合物Ⅲ、Ⅳ为首次从赤芝子实体中分离得到,化合物Ⅷ、Ⅹ为首次从灵芝属中分离得到。

1仪器与材料

N-1000旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社生产）;RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;U-2000型紫外分光光度仪（日本日立）;SartoriousBT25S型十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）;DS电热三用水浴锅（北京医疗设备厂）。

柱色谱硅胶（200-300目）、硅胶G薄层板（20×20cm）及薄层色谱制备板（20×20cm）（青岛海洋化工厂）;C18反相硅胶薄层（德国Merck公司）;SephadexLH-20（Pharmacia公司）;MCI填充材料（日本东京Mitsubishi公司）;ODS反相填料（日本YMC公司）;展开剂:

（1）石油醚:

三氯甲烷:

甲醇（5:

5:

1）,

（2）石油醚:

三氯甲烷:

甲醇（5:

5:

2）;薄层显色剂:

10%硫酸乙醇;其他试剂均为分析纯。

药材购自北京同仁堂望京药店有限责任公司,经北京中医药大学中药鉴定系刘春生教授鉴定为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝Ganodermalucidum（Ley-ss.exFr.）Karst.的干燥子实体。

2提取与分离

赤芝干燥子实体约30Kg,用8倍量70%乙醇浸泡过夜,分别回流提取3次,依次为2h、1.5h、1.5h,滤过,合并提取液,减压浓缩至无醇味,加蒸馏水混匀粗提取稀释至12L,用乙酸乙酯和正丁醇萃取,减压回收溶剂,得乙酸乙酯萃取物（463g）。

乙酸乙酯部分硅胶干柱氯仿-甲醇（4:

1）洗脱,TLC检测合并相同的组分,得到三个洗脱组分Fr.1,Fr.2,Fr.3。

Fr.1部分经硅胶柱色谱分离,石油醚-乙酸乙酯（100:

1-0:

100）梯度洗脱4个亚流分Fr.1A-1D。

Fr.1A与Fr.1B重结晶得化合物Ⅸ（10mg）、Ⅹ（2mg）;Fr.1C与Fr.1D经反复硅胶柱层析,二氯甲烷-乙酸乙酯（10:

1-0:

1）梯度洗脱和薄层制备得到化合物Ⅰ（5mg）、Ⅱ（7mg）。

Fr.2部分经硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇（40:

1-1:

1）梯度洗脱6个亚流分Fr.2A-2F。

Fr.2B经反复硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯-甲醇（40:

1:

1-1:

1:

1）梯度洗脱,经SephadexLH-20凝胶柱色谱,氯仿-甲醇（1:

1）洗脱,所得流分再经硅胶柱色谱,石油醚-氯仿-甲醇（5:

5:

1）洗脱,得化合物Ⅲ（4mg）;Fr.2C经反复硅胶柱层析,石油醚-氯仿-甲醇（20:

1:

1-1:

1:

1）梯度洗脱,经SephadexLH-20凝胶及ODS柱色谱,氯仿-甲醇（1:

1）洗脱,所得流分再经硅胶柱色谱,石油醚-氯仿-甲醇（5:

5:

2）洗脱,得化合物Ⅳ（5mg）、Ⅴ（5mg）、Ⅵ（8mg）。

Fr.3部分经硅胶柱色谱分离,二氯甲烷-甲醇（80:

1-0:

1）梯度洗脱5个亚流分Fr.3A-3E。

Fr.3B经反复硅胶柱层析,二氯甲烷-乙酸乙酯（6:

1）洗脱,重结晶得化合物Ⅶ（5mg）;Fr.3D与Fr.3E经反复硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯-甲醇（20:

1:

1-1:

1:

1）梯度洗脱,再经反复SepLH-20、MCI及ODS柱色谱,纯甲醇洗脱,得化合物Ⅷ（16mg）、Ⅺ（7mg）。

3结构鉴定

化合物Ⅰ:

白色针状晶体（乙酸乙酯）,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

ESI-MSm/z:

474[M+H]+,分子式为C27H38O7。

1H-NMR（CDCl3,500MHz）δ：

1.05,1.18,1.28,1.48,1.50（各3H,s,H-Me）,1.30（3H,d,J=7.0Hz,H-Me）,3.49（1H,dd,J=4.5,11.5Hz,H-3）,5.24（1H,t,J=8.5Hz,H-7）,4.52（1H,s,H-12）;13C-NMR（CDCl3,125MHz）δ:

34.50（C-1）,28.20（C-2）,78.18（C-3）,38.70（C-4）,49.39（C-5）,27.99（C-6）,66.03（C-7）,156.03（C-8）,141.44（C-9）,37.61（C-10）,199.39（C-11）,78.18（C-12）,51.69（C-13）,60.23（C-14）,217.2（C-15）,38.87（C-16）,47.60（C-17）,12.46（C-18）,18.77（C-19）,31.64（C-20）,20.67（C-21）,29.69（C-22）,29.35（C-23）,176.35（C-24）,27.93（C-28）,15.44（C-29）,22.68（C-30）。

以上数据与文献报道基本一致[3],故鉴定化合物Ⅰ为赤芝酸C（lucidenicacidC）。

化合物Ⅱ:

白色针状晶体（乙酸乙酯）,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

分子式为C26H38O3。

1H-NMR（CDCl3,500MHz）δ:

3.64（3H,s,O-Me）,1.09（1H,dd,J=5.0,10.6Hz,H-5）,5.48（1H,m,H-7）,5.32（1H,d,J=6.1Hz,H-11）,2.10（2H,d,J=17.6Hz,H-12）,2.23（1H,dd,J=6.8,10.7Hz,H-20）,1.20（3H,d,J=6.8Hz,H-21）,δ1.00,0.99,0.93,0.88,0.57（各3H,s,H-Me）;13C-NMR（CDCl3,125MHz）δ:

35.72（C-1）,27.81（C-2）,78.98（C-3）,38.71（C-4）,49.12（C-5）,23.00（C-6）,120.22（C-7）,139.86（C-8）,145.53（C-9）,37.37（C-10）,115.49（C-11）,37.81（C-12）,43.81（C-13）,50.32（C-14）,25.89（C-15）,31.49（C-16）,49.12（C-17）,15.41（C-18）,22.74（C-19）,43.81（C-20）,15.78（C-21）,179.6（C-22）,25.55（C-28）,28.14（C-29）,15.66（C-30）,50.86（C-O-Me）。

以上数据与文献报道基本一致[8],故鉴定化合物Ⅱ4,4,14α-trimethyl-3-oxo-5α-pregna-7,9（11）-diene-20S-carboxylate。

化合物Ⅲ:

白色粉末,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

ESI-MSm/z:

457[M+H]+,分子式为C30H48O3。

1H-NMR（C5D5N,500MHz）δ:

2.97（1H,dd,J=8.6,14.9Hz,H-1）,1.67（2H,m,H-2）,3.46（1H,dd,J=7.8,12.7Hz,H-3）,3.48（1H,d,J=9.5Hz,H-7）,1.73（2H,m,H-6）,2.65（1H,d,J=15.7Hz,H-12）,2.56（1H,d,J=15.7Hz,H-12）,1.87（1H,m,H-15）,1.73（1H,m,H-15）,2.00（2H,m,H-16）,1.72（1H,m,H-17）,1.88（1H,m,H-23）,5.23（1H,t,J=6.6Hz,H-24）,1.62（3H,s,H-26）,1.51（3H,s,H-27）,1.04（3H,s,H-28）,0.83（3H,s,H-29）,1.26（3H,s,H-30）;13C-NMR（C5D5N,500MHz）δ:

34.1（C-1）,27.87（C-2）,77.48（C-3）,38.99（C-4）,47.46（C-5）,28.18（C-6）,69.35（C-7）,160.42（C-8）,141.78（C-9）,38.9（C-10）,199.93（C-11）,52.19（C-12）,50.10（C-13）,47.48（C-14）,29.98（C-15）,27.84（C-16）,50.10（C-17）,16.66（C-18）,17.39（C-19）,35.61（C-20）,17.69（C-21）,35.61（C-22）,23.50（C-23）,123.88（C-24）,131.2（C-25）,23.50（C-26）,17.42（C-27）,28.28（C-28）,16.06（C-29）,28.84（C-30）。

以上数据与文献报道基本一致[9],故鉴定化合物Ⅲ为3,7二羟基羊毛甾-8,23-二烯-11-酮（（3β,7α）-3,7-dihydroxylanosta-8,24-dien-11-one）。

为首次从赤芝子实体中分离得到。

化合物Ⅳ:

黄色油状固体,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

ESI-MSm/z:

531[M+H]+,分子式为C31H46O7。

1H-NMR（C5D5N,500MHz）δ:

3.57（3H,s,O-Me）,2.91（1H,dd,J=8.4,17.8Hz,H-3）,4.96（1H,dd,J=7.2,9.9Hz,H-7）,5.49（1H,s,H-15）,5.44（1H,s,H-16）,2.78（1H,m,H-1）,1.61（2H,m,H-2）,0.95（1H,m,H-5）,1.96（1H,dd,J=7.6,17.6Hz,H-6）,3.12（1H,d,J=15.0Hz,H-12）,3.02（1H,d,J=15.0Hz,H-12）,2.50（1H,m,H-20）,2.54（1H,dd,J=6.8,16.6Hz,H-22）,2.40（1H,m,H-24）,2.73（1H,m,H-25）,1.25（3H,s,H-18）,1.22（3H,s,H-19）,1.02（3H,d,J=6.4Hz,H-21）,1.11（3H,d,J=7.1Hz,H-27）,1.03（3H,s,H-28）,1.01（3H,s,H-29）,1.02（3H,s,H-30）;13C-NMR（C5D5N,125MHz）δ:

34.77（C-1）,28.65（C-2）,77.03（C-3）,39.24（C-4）,49.52（C-5）,28.59（C-6）,69.32（C-7）,161.39（C-8）,141.47（C-9）,39.20（C-10）,199.79（C-11）,46.65（C-12）,51.56（C-13）,56.48（C-14）,77.43（C-15）,123.89（C-16）,154.22（C-17）,22.46（C-18）,19.62（C-19）,27.78（C-20）,20.22（C-21）,48.54（C-22）,207.57（C-23）,48.29（C-24）,35.27（C-25）,176.17（C-26）,16.99（C-27）,28.83（C-28）,16.65（C-29）,23.46（C-30）,52.10（C-O-Me）。

以上数据与文献报道基本一致[10],故鉴定化合物Ⅳ为3β,7β,15β-三羟基-11,23-二羰基羊毛甾-8,16-二烯-26-烷酸甲酯（3β,7β,15β-trihydroxy-11,23-dioxo-lanost-8,16-dien-26-oicacidmethylester）。

为首次从赤芝子实体中分离得到。

化合物Ⅴ:

白色晶体,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

分子式为C31H48O7。

1HNMR（C5D5N,500MHz）δ:

3.57（3H,s,O-Me）,3.02（1H,dd,J=4.5,10.1Hz,H-3）,1.49（1H,dd,J=9.6,19.1Hz,H-7）,4.96（1H,m,H-7）,4.95（1H,d,J=8.0Hz,H-15）,2.63（1H,d,J=15Hz,H-15）,2.23（1H,dd,J=9.9,16.0Hz,H-6）,2.91（1H,m,H-6）,2.76（1H,d,J=15Hz,H-16）,2.01（1H,m,H-20）,2.41（2H,dd,J=6.8,12.9Hz,H-22）,2.49（1H,dd,J=5.3,10.1Hz,H-24）,2.51（1H,dd,J=4.1,8.4Hz,H-25）,δ1.25,1.24,1.07,1.04,0.89（3H,s,H-18,19,28,29,30）,1.12（3H,d,J=7.2Hz,H-27）;13CNMR（C5D5N,125MHz）δ:

34.80（C-1）,27.83（C-2）,77.83（C-3）,38.95（C-4）,49.67（C-5）,28.15（C-6）,69.40（C-7）,160.35（C-8）,141.77（C-9）,38.5（C-10）,199.89（C-11）,51.59（C-12）,47.41（C-13）,54.62（C-14）,72.21（C-15）,35.61（C-16）,48.31（C-17）,17.07（C-18）,19.59（C-19）,33.06（C-20）,19.61（C-21）,49.76（C-22）,208.65（C-23）,46.48（C-24）,34.80（C-25）,176.13（C-26）,17.04（C-27）,28.69（C-28）,16.57（C-29）,19.4（C-30）,51.57（C-O-Me）。

以上数据与文献报道基本一致[11],故鉴定化合物Ⅴ为甲基灵芝酸C2（methylganoderateC2）。

化合物Ⅵ:

白色粉末,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

ESI-MSm/z:

421[M+H]+,分子式为C25H41O5。

1H-NMR（C5D5N,500MHz）δ:

3.54（1H,dd,J=5.0,11.5Hz,H-3）,4.94（1H,d,J=7.0Hz,H-7）,5.82（1H,dd,J=7.0,11.6Hz,H-15）,3.55（1H,dd,J=2.8,11.0Hz,H-22）,3.18（2H,d,J=13.5Hz,H-1）,1.91（2H,m,H-2）,1.18（1H,m,H-5）,2.45（1H,m,H-6）,2.95（2H,dd,J=7.0,14.5Hz,H-12）,2.21（2H,m,H-16）,1.64（3H,m,H-20）,δ1.06,1.49,1.24,1.06,1.49（3H,s,H-18,19,28,29,30）,1.07（3H,d,J=9.2Hz,H-21）;13C-NMR（C5D5N,125MHz）δ:

35.36（C-1）,28.88（C-2）,77.47（C-3）,39.27（C-4）,49.93（C-5）,28.95（C-6）,69.44（C-7）,160.37（C-8）,141.76（C-9）,39.25（C-10）,199.90（C-11）,52.64（C-12）,47.44（C-13）,54.64（C-14）,72.25（C-15）,36.92（C-16）,47.44（C-17）,17.69（C-18）,20.06（C-19）,39.32（C-20）,17.41（C-21）,69.34（C-22）,28.71（C-28）,16.65（C-29）,20.20（C-30）。

以上数据与文献报道基本一致[12],故鉴定化合物Ⅵ为3,7,15,22-四羟基羊毛甾-11-酮（ganosineniolA）。

化合物Ⅶ:

白色针状晶体,Libermann-Burchard反应阳性,10%硫酸乙醇显色为粉色。

ESI-MSm/z:

474[M+H]+,分子式为C27H38O7。

1H-NMR（CD3OD,500MHz）δ:

1.61（1H,s,H-5α）,4.57（1H,m,H-7α）,4.84（1H,m,H-15β）,1.50（1H,m,H-1α）,2.48（1H,m,H-2α）,1.77（1H,m,H-6α）,1.60（1H,m,H-6β）,3.04（1H,d,J=15.7Hz,H-12α）,2.46（1H,d,J=15.7Hz,H-12β）,2.71（1H,m,H-16α）,3.18（1H,m,H-17α）,0.78（3H,s,H-18）,1.27（3H,s,H-19）,2.06（3H,s,H-21）,1.19（3H,s,H-28）,1.07（3H,s,H-29）,1.27（3H,s,H-30）;13C-NMR（CD3OD,125MHz）δ:

220.04（C-3）,200.81（C-11）,210.53（C-20）,161.60（C-8）,141.28（C-9）,36.68（C-1）,35.16（C-2）,47.73（C-4）,49.62（C-5）,29.88（C-6）,69.52（C-7）,39.19（C-10）,51.65（C-12）,47.84（C-13）,55.43（C-14）,73.26（C-15）,30.68（C-16）,57.12（C-17）,19.34（C-18）,19.85（C-19）,31.30（C-21）,27.78（C-28）,20.25（C-29）,21.03（C-30）。

以上数据与文献报道基本一致[13],故鉴定化合物Ⅶ为赤芝酮F（lucidoneF）。

化合物Ⅷ:

白色固体（甲醇）,10%硫酸乙醇显色为蓝紫色。

ESI-MSm/z:

859[2M-H]+,分子式为C28H46O3。

1H-NMR（DMSO,500MHz）δ:

5.07（1H,m,H-7）,5.23（1H,m,H-22）,